一种快速高效检测鱼源性寄生虫囊蚴的方法技术

本发明专利技术提供一种快速高效检测鱼源性寄生虫囊蚴的方法：1）将样品剪成碎小状，按（20-50ml）/300g比例加入胃蛋白酶溶液，匀浆机搅拌至匀浆状，移入烧杯；2）按(200-500ml)/300g比例加入胃蛋白酶溶液，恒温箱中放置1.5-3h，加满水，搅拌后沉淀1-3min，弃上清；3）筛网过滤；4）重复沉淀滤洗直至上清较清澈；5）将沉淀移至盛有少量生理盐水的培养皿，轻微摇动使沉淀集中于中部；6）观察并鉴定囊蚴；其中所述的胃蛋白酶溶液为每1,000mlH2O中含8ml浓盐酸和6g胃蛋白酶（1:10,000U）的溶液。本发明专利技术方法显著缩短了检测时间，减少了酶的用量，并能在较长时间内保持囊蚴存活，检出率高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及水产养殖中鱼的寄生虫检测，具体地说，是一种快速高效检测鱼源性寄生虫囊蝴的方法。
技术介绍
食源性寄生虫是指通过饮食传播引起人类疾病的寄生虫。食物与寄生虫的关系包括两种:一是食物本身含有各期发育不同阶段的寄生虫，在加工或烹调过程中，未将其杀死而吃后感染，这些食物称为寄生性食物，尤以动物性食物为主；二是食物本身不含寄生虫，只是在生长、运输、加工过程中被寄生虫虫卵或包囊、囊蝴、卵囊所污染而吃后感染，这些食物称为污染性食物，一般以植物性食物为主。食源性寄生虫病按寄生食物种类划分，大体可分为鱼源性寄生虫病、螺源性寄生虫病、肉源性寄生虫病、两栖类与爬行类寄生虫病、植物源性寄生虫病和昆虫类寄生虫病等。其中鱼源性寄生虫病中又包括华支睾吸虫病，该病又称肝吸虫病，是由华支睾吸虫寄生在人的肝胆管内所引起的肝胆病变为主的一种人兽共患寄生虫病，是当前我国最严重的食源性寄生虫病之一。华支睾吸虫(CVozjorcAj's隶属于后睾科,支睾吸虫属。该吸虫背腹扁平，稍狭长，长宽为(8-15) X (l_4)mm，寄生于人、哺乳类动物的肝胆管内，引起胆管炎、胆囊炎、肝肿大、肝受损等疾患，称华支睾吸虫病，俗称肝吸虫病。人体感染是因食生的或未煮熟的含有其囊蝴的第二中间宿主鱼、虾而引起的。沼螺与淡水鱼虾分别是华支睾吸虫的第1、2中间宿主，国内外迄今已报告132种鱼、3种虾可充当华支睾吸虫的第2中间宿主，如鲤鱼、鲫鱼、草鱼、白鲢、麦穗鱼、米虾、沼虾等。目前已有通过压 片法和常规消化法等来检测鱼体内寄生虫囊蝴的方法，压片法具体操作为:采集样品鱼，分别取鱼鳃、鱼背、鱼鳍基部约豌豆大小的肌肉组织，压成薄片后在解剖镜下观察组织样品中是否存在华支睾吸虫囊蝴。常规消化法具体操作为:将样品鱼进行称重，并剪成碎小状，放入烧杯中，按照鱼重量:消化液体积=1: 10加入消化液(2g胃蛋白酶溶于IOOml双蒸水中，使用前加0.7ml 100%浓盐酸)，37°C消化6_8h。消化产物用80目网筛过滤，静置30min后弃去上清液，重复水洗沉淀步骤直至上清液澄清。将沉淀吸入平皿，用解剖镜检查是否有囊蝴存在。但上述两种方法检出率和操作步骤都有一定局限性。压片法检出率不高，容易造成漏检、误检，同时不易操作，需要具有一定经验才可掌握，并对囊蝴外观形态具有一定破坏性，不易进行种类鉴定；常规消化法虽然具有较高的检出率，同时也能够保证囊蝴的完整程度，但因为其耗时过久，对基层操作和大规模的调查检测具有一定局限性，难以满足现阶段大规模采样检测的需求。因此亟需一种快速高效、检出率高且对囊蝴外观形态破坏性小的检测方法，但是目前关于这类方法还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种快速高效检测鱼源性寄生虫囊蝴的方法。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案是: 一种快速高效检测鱼源性寄生虫囊蝴的方法，包括以下步骤: 1)将样品剪成碎小状，加入胃蛋白酶溶液，所述的胃蛋白酶溶液体积与样品重量的比例是(20-50ml) /300g，用匀浆机将混合好的样品搅拌至匀浆状，将匀浆液移入烧杯； 2)向烧杯中加入胃蛋白酶溶液，所述的胃蛋白酶溶液体积与样品重量的比例是(200-500ml)/300g，混匀后于37°C恒温箱中放置1.5_3h (根据样品组成情况，可适当延长时间)，向烧杯中加满水，搅拌后沉淀l_3min，弃去一定体积的上清液； 3)用筛网过滤，并用适量水边冲洗边过滤； 4)向滤液中加水后搅拌并静置l_3min，弃上清液，再加水沉淀，重复沉淀滤洗直至上清液较为清澈； 5)将沉淀移至盛有少量生理盐水的培养皿中，顺时针轻微摇动培养皿使沉淀集中于培养皿中部； 6)在显微镜下观察并鉴定寄生虫囊蝴； 其中，所述的胃蛋白酶溶液为每1，000ml H2O中含8ml浓盐酸和6g胃蛋白酶(1:10，000U )的溶液，所述的胃蛋白酶为1:10，000U。优选的，步骤I)中所述的样品的重量彡300g ;取样时，如整条鱼重量彡300g，则解剖整条鱼剪碎匀浆，如整条鱼重量> 300g，则解剖整条鱼后从鱼的不同部位按比例取适量样品，剪碎后混合匀浆。优选的，在步骤2)中所述的“于37°C恒温箱中放置1.5_3h”期间搅拌3_8次。优选的，步骤2)中所述的水为自来水，但不仅限于此，也可以是蒸馏水、无菌水等。步骤3)所述的筛网的孔径为80-150目。所述的方法还包括分离收集囊蝴。所述的方法还包括按以下公式计算感染度:感染度=样品中囊蝴的数量/样品的重量。本专利技术优点在于: 1、本专利技术的方法与常规消化法相比:1)增加了使用搅拌机对样品组织块搅拌的步骤，利用工具加工使样品组织成为匀浆状组织液，便于胃蛋白酶液进行消化；2)在搅拌前向样品组织中加入少量胃蛋白酶液，使之在搅拌过程中能与样品充分接触，可缩短酶液的反应时间；3)在样品组织经胃蛋白酶消化后，增加了向烧杯中加入水，搅拌沉淀，弃去上清的步骤，然后再进行筛网过滤，该增加的步骤可稀释匀浆状组织液，便于降低粘稠度，从而提高过滤效率，减少过滤次数。因而本专利技术的方法缩短了整个检测过程的时间，仅需1.5-3h，而常规消化法需要6_8h ； 2、相比于常规消化法，本专利技术的方法通过采取上述促进胃蛋白酶和样品组织接触的措施，减少了胃蛋白酶的用量； 3、本专利技术的方法在实施过程中对囊蝴伤害小，分离出囊蝴后，能够在较长时间段内保持囊蝴存活，便于后期相关操作； 4、本专利技术的方法检出率高，与常规消化法相比无显著差异。附图说明附图1是华支睾吸虫囊蝴显微图。具体实施例方式下面结合附图对本专利技术提供的具体实施方式作详细说明。本文中，鲩鱼采集自广东茂名市农贸市场，胃蛋白酶(1:10，000U)购于国药集团化学试剂有限公司。实施例1-5中所述的胃蛋白酶溶液为每1，000ml H2O中含8ml浓盐酸(12 mol/L)+6g胃蛋白酶(1:10，000U);鱼体内寄生虫感染度，即每克鱼中囊蝴的数量的计算公式为:感染度=样品中囊蝴的数量/样品的重量。实施例1 ■鱼华支睾吸虫(67oflorcAis囊蝴的检测 1)取样，测量并记录鱼的大小和重量300g，解剖后将样品剪成碎小状，加入30ml胃蛋白酶溶液，然后用匀浆机搅拌至匀浆状，将匀浆液移入IL烧杯中； 2)加入胃蛋白酶溶液300ml左右，混匀后于37°C恒温箱中放置2.5h (期间搅拌3次)，向烧杯中加满自来水，搅拌后沉淀2min，弃去2/3体积的上清液； 3)用150目筛网过滤，并用适量水边冲洗边过滤，收集滤液； 4)向滤液中加水后搅拌并静置1.5min，弃上清液，再加水沉淀，重复5次直至上清液较为清澈； 5)将沉淀移至盛有少量生理盐水的培养皿中，顺时针轻微摇动培养皿使沉淀集中于培养皿中部； 6)在显微镜下观察并鉴定寄生虫囊蝴(华支睾吸虫囊蝴显微图如图1所示，可见囊蝴形状保持完整，外观形态受到的破坏小)，将囊蝴进行分离收集，计数； 7)按照公式计算鱼体内寄生虫感染度。实施例2钩棘单睾吸虫/WffiiJrO)囊蝴的检测 1)取样，测量并记录鱼的大小和重量465g，解剖后从鱼的不同部位(头、鳃、肌肉、鳍、鳞片、肠和其余内脏)按比例取适量样品，将各个部位的样品混合，混合后总重量为300g，剪本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速高效检测鱼源性寄生虫囊蚴的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）将样品剪成碎小状，加入胃蛋白酶溶液，所述的胃蛋白酶溶液体积与样品重量的比例是（20?50ml）/300g，用匀浆机将混合好的样品搅拌至匀浆状，将匀浆液移入烧杯；2）向烧杯中加入胃蛋白酶溶液，所述的胃蛋白酶溶液体积与样品重量的比例是(200?500ml)/300g，混匀后于37℃恒温箱中放置1.5?3h，向烧杯中加满水，搅拌后沉淀1?3min，弃去一定体积的上清液；3）用筛网过滤，并用适量水边冲洗边过滤；4）向滤液中加水后搅拌并静置1?3min，弃上清液，再加水沉淀，重复沉淀滤洗直至上清液较为清澈；5）将沉淀移至盛有少量生理盐水的培养皿中，轻微摇动培养皿使沉淀集中于培养皿中部；6）在显微镜下观察并鉴定寄生虫囊蚴；其中，所述的胃蛋白酶溶液为每1,000ml?H2O中含8ml浓盐酸和6g胃蛋白酶的溶液，所述的胃蛋白酶为1:10,000U。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘利平，李慷，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：