一种乳头注射慢病毒建立树鼩乳腺癌模型的方法技术

本发明专利技术为一种乳头注射慢病毒建立树鼩乳腺癌模型的方法。采用乳头注射技术把慢病毒导入到树鼩乳腺导管内，从而介导导管内上皮细胞感染后过表达癌基因或敲低抑癌基因，从而诱发树鼩乳腺肿瘤。本发明专利技术表达癌基因PyMT最快2周时间即可触摸到乳腺肿瘤产生，且诱导成功率接近100%，其潜伏期短、特异性强、诱发率极高、稳定方便且操作简单。采用本发明专利技术所述方法可以快速高效建立树鼩乳腺癌模型。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及人类疾病动物模型的制作
，特别涉及慢病毒介导癌基因过表达或抑癌基因敲低诱导建立树駒乳腺癌模型的方法。
技术介绍
目前，有关乳腺癌研究主要是以啮齿类动物建立的乳腺癌模型，但因其与人类存在很大差异而不能完全模拟人类疾病，而非人灵长类动物虽是最理想的模型动物，却价格昂贵。树駒在生物学分类地位上仅次于高等灵长类动物，比啮齿类更接近人类，而且价格便且。早在1966年，Elliot等人在《nature》上首次报道了一例树駒的自发性乳腺癌。之后，国内外再也没有任何关于树駒乳腺肿瘤模型的报道。在本课题组的前期工作中发现了 5例树駒自发乳腺肿瘤，HE染色和免疫组化结果显示，其中四例肿瘤的形态和病理与人导管内乳头状肿瘤非常类似。另有一例为浸润性导管癌，并伴随有肺转移，这和人的乳腺导管癌非常接近。这提示用树駒作为乳腺癌研究模型是可行的。而有关人工诱导的乳腺癌模型，尚未见到任何报道。现有的乳腺癌动物模型主要可以分为3类:1)移植瘤模型；2)物理和化学致癌剂诱导动物产生肿瘤模型；3)转基因模型。由于缺乏免疫缺陷的树駒品系，将人的乳腺癌组织移植到树駒基本不可能成功。而基于胚胎干细胞的树駒转基因技术还没有建立，因此通过传统的干细胞转基因技术(过量表达癌基因或者敲除抑癌基因)建立树駒乳腺癌模型也不可行。选择物理、化学或者生物方法来诱发树駒乳腺癌是目前唯一可行的策略。常规的乳腺癌诱导方式如化学致癌剂DMBA耗费时间周期长，诱发率低，模型一致性较差。前面提到，基于胚胎干细胞的树駒转基因技术还不 成熟，而慢病毒作为一种特殊的逆转录病毒，具有可感染各种哺乳动物分裂细胞及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点，因此也可以特异有效的将所选基因在树駒乳腺上皮细胞过度表达或敲低，从而诱发树駒乳腺癌。
技术实现思路
本专利技术的目的在于基于现有树駒乳腺癌模型建立技术的空白而提供一种潜伏期短、特异性强、诱发率极高、稳定方便且操作简单的树駒乳腺癌模型建立方 法，采用该方法建立的树駒乳腺癌模型可以用于抗癌药物的临床前的安全性和有效性评价。本专利技术的建立树駒乳腺癌模型的方法包括如下主要步骤:病毒载体构建、病毒包装；树駒乳腺乳头注射，把病毒液注射到乳腺导管；乳腺组织荧光检测；乳腺肿瘤观察和病理鉴定，具体为: (I)病毒载体的构建 商品化或自行构建的慢病毒载体均可用该方法建立树駒乳腺肿瘤模型，可以根据载体图谱构建过表达癌基因或敲低抑癌基因的所需载体； (2)病毒包装和滴度测定 将慢病毒表达质粒和包装质粒pRev、pMDL和pVSVG共同转染HEK293T宿主细胞，转染24小时后更换新鲜DMEM培养基；转染48小时后收集培养上清，低速离心后去除细胞碎片，再通过0.45 μ M滤器(Millipore)初次过滤,然后用超滤浓缩离心管(AmiconUltra-15 Centrifugal Filter Devices,Millipore)浓缩病毒颗粒，在此基础上还可通过超高速离心进一步浓缩病毒颗粒，最后将病毒液梯度稀释后感染HEK293T，两天后流式细胞术测定病毒感染滴度(TU/ml)； (3)树駒乳头注射慢病毒 选取野生驯养或者人工繁殖子代性成熟的雌性树駒(3 4月龄)，按体重随机分为3组:①空白对照组:乳腺导管内注射生理盐水；②阴性对照组:乳腺导管内注射仅表达绿色荧光蛋白EGFP的慢病毒；③慢病毒组:乳腺导管内注射过表达癌基因或敲低抑癌基因的慢病毒。将树駒麻醉后固定；树駒乳头用酒精消毒以后，齐根部剪去，使用专用微量注射器将病毒液注入树駒乳腺导管中，每个乳头注入10 μ 1，病毒液中加入trypan blue做为示踪染料，成功注入后可见蓝色病毒液进入乳腺导管系统呈树枝状分布； (4)乳腺组织荧光检测 乳头注射I周以后，通过解剖和冰冻切片可以检测到阴性对照组和慢病毒组树駒乳腺注射组织均有绿色荧光蛋白表达； (5)乳腺肿瘤观察和病理鉴定 在乳头注射慢病毒以后，每周观察树駒乳腺部位肿瘤生长情况，每次观察时用手触摸乳腺部位是否有硬结，当触摸到硬结时，之前的时间段记为肿瘤生长潜伏期；之后每周测量肿瘤大小，直到肿瘤最长径达到2cm左右，手术活取乳腺肿瘤组织，通过H&E (苏木精-伊红)组织染色后鉴定树駒乳腺肿瘤所属类型。目前树駒乳腺癌模型建立方法在国内外均为空白，本专利技术具有如下的有益效果: (I)本专利技术为建立树駒乳腺癌模型提供了一种快捷高效的方法，本实验室通过乳头注射过表达PyMT的病毒液后平均3周，最快2周即可诱发乳腺癌，周期非常短，而且诱发成功率基本达100%。(2)以病毒为载体，可以把研究者感兴趣的各种癌基因或抑癌基因通过慢病毒感染上皮细胞而表达或敲低，从而建立乳腺癌模型来进行验证；慢病毒介导的基因操作具有乳腺癌发生效率高，潜伏时间短，模型一致性好等优点。(3)对实验室条件要求不高，只需要普通细胞培养间及普通级动物实验室即可完成实验，注射工具为微量注射器和眼科剪，因此该方法具备广泛推广使用的潜能，只需操作者在注射技术方面稍加练习即可。树駒乳腺癌模型将可能比传统的啮齿类动物乳腺癌模型更好模拟人类乳腺癌的发生、发展、和药物治疗反应。因此本专利技术建立的新型树駒乳腺癌模型不仅在乳腺癌基础研究上，而且在药物临 床前的安全性和有效性评价上有不可限量的应用潜力。具体实施方式为使本专利技术更加容易理解，下面将进一步阐述本专利技术的具体实施实例。1、病毒载体的构建 本专利技术实施实例中所用到的多瘤中间T抗原(PyMT)、EGFP慢病毒表达载体和包装载体质粒由合作者美国Baylor医学院李毅提供。所用的病毒载体为常规的慢病毒载体，其包装的病毒颗粒能够感染并将其基因整合到树駒乳腺上皮细胞基因组中。2、病毒包装和滴度测定 将PyMT、EGFP基因表达载体FU-CGW分别和包装载体pRev、pMDL及pVSVG共同转染HEK293T细胞，转染24小时后更换新鲜DMEM培养基，转染48小时后收集培养上清，低速离心后去除细胞碎片，再通过0.45 μ M滤器(Millipore)初次过滤，然后用超滤浓缩离心管(Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Devices,Millipore)浓缩病毒颗粒，在此基础上还可通过超高速离心进一步浓缩病毒颗粒。最后将病毒液梯度稀释后感染HEK293T，两天后用流式细胞术测定病毒感染滴度。由于癌基因PyMT致癌能力很强，病毒感染滴度达到IXlO6 TU/ml以上便可用于注射诱导。3、病毒注射 (1)选取3-4月龄的雌性树駒，用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，将其固定在消毒泡沫板上，用大头针固定四肢； (2)用剃毛刀将树駒腹部被毛剃光后，用酒精消毒双侧乳头； (3)用消毒好的眼科剪齐根部剪去树駒乳头； (4)病毒液染色，将染细胞用的0.4% trypan blue染料按1:10的比例加入到病毒液中，混匀； (5)用事先消毒晾干的微量注射器向每个乳头注射ΙΟμΙ病毒液；病毒成功注射到乳腺导管后，透过皮肤可以看到蓝色的病毒液进入乳腺导管系统，呈树枝状分布。2、肿瘤观察及病理鉴定 在注射病毒液2周后，在乳腺部位触摸到硬结，当肿瘤生长到最长径2cm左右后，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种乳头注射慢病毒建立树鼩乳腺癌模型的方法，其特征在于采用乳头注射技术把慢病毒导入到树鼩乳腺导管内，从而介导导管内上皮细胞感染后过表达癌基因或敲低抑癌基因，从而诱发树鼩乳腺肿瘤，建立树鼩乳腺癌模型。

【技术特征摘要】
1.一种乳头注射慢病毒建立树駒乳腺癌模型的方法，其特征在于采用乳头注射技术把慢病毒导入到树駒乳腺导管内，从而介导导管内上皮细胞感染后过表达癌基因或敲低抑癌基因，从而诱发树駒乳腺肿瘤，建立树駒乳腺癌模型。2.根据权利要求1所述的乳头注射慢病毒建立树駒乳腺癌模型的方法，其特征在于按以下步骤进行: (1)病毒载体的构建 商品化或自行构建的慢病毒载体，根据载体图谱构建过表达癌基因或敲低抑癌基因的所需载体； (2)病毒包装和滴度测定 将慢病毒表达质粒和包装质粒pRev、pMDL和pVSVG共同转染HEK293T宿主细胞，转染24小时后更换新鲜DMEM培养基；转染48小时后收集培养上清，低速离心后去除细胞碎片，再通过0.45 u M滤器初次过滤，然后用超滤浓缩离心管浓缩病毒颗粒，在此基础上还可通过超高速离心进一步浓缩病毒颗粒，最后将病毒液梯度稀释后感染HEK293T，两天后流式细胞术测定病毒感染滴度； (3)树駒乳头注射慢病毒 选取野生驯养...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈策实，夏厚军，何保丽，角建林，
申请(专利权)人：中国科学院昆明动物研究所，
类型：发明
国别省市：