利用克隆型谱监测健康和疾病状态制造技术

需要改进的用于明确患有病状的患者的诊断和预后的方法，尤其是针对自身免疫性疾病和癌症，特别是淋巴肿瘤，如淋巴瘤和白血病。本文提供了利用DNA测序鉴定淋巴肿瘤、自身免疫性疾病和其他病状患者中的个性化或患者特异性生物标记物的方法。鉴定的生物标记物可以用来确定和/或监测患有相关淋巴病状或自身免疫性疾病或其他病状的受试者的疾病状态。特别是，本发明专利技术提供了用于监测经历克隆进化的淋巴肿瘤的灵敏方法，而不需要针对作为患者特异性生物标记物的进化的或突变的克隆开发替代试验。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术一般地涉及通过分子测量来监测个体的健康和疾病状况，更具体地涉及通过利用高通量DNA测序测量免疫系统分子谱(profile)来监测个体的健康和疾病状况。
技术介绍
适应性免疫系统，包括体液(或B细胞介导的)应答和细胞毒性(或T细胞介导的)应答，已经进化为可以攻击其各自靶标上的特异性分子特征。出现一次针对特异性靶标的应答就能给宿主提供“记忆”，使其能够在相同目标再次出现时产生更强的应答。任何蛋白质或多糖通常都可作为某些适应性免疫应答细胞亚群或其产物的靶标，这些适应性免疫应答细胞亚群或其产物能识别靶标上特异性分子特征或表位。由于自身免疫疾病涉及到适应性免疫系统的某些成分对自身靶标的识别，因此已检查了适应性免疫系统的各方面，来帮助此类疾病的诊断和预后。使用标准免疫学技术，通过寻找循环自身抗体，已对体液免疫系统进行了研究。已针对多种疾病鉴定了自身抗体，如抗核抗体、抗dsDNA抗体及类风湿因子。这些抗体可能本身不具有病理性，它们在体内识别的靶标也不一定与在体外检测的靶标相同；但是，它们的水平的检测有助于诊断，并且在一些情况下具有一定的预后和治疗意义。另一种研究自身免疫性疾病和淋巴疾病中的适应性免疫系统的方法是基于适应性免疫细胞多样性的分析。适应性免疫细胞的激活导致其克隆增殖。通常通过从血液RNA或DNA扩增编码抗原识别区的核酸序列的部分来获得这种克隆增殖的证据。例如，用于扩增具有T细胞受体β链(类似于抗体重链)的特定V区段的序列的PCR引物可以用于扩增连接到特定V区段的J区段或J和D区段。当存在多样化的细胞群时，本来应该扩增具有大小略微不同的扩增子分布的片段，但克隆增殖会导致特定大小的扩增子被富集，并因此在凝胶上显示为更强烈的条带。在被称为“谱型分析(spectratyping)”的技术中，每个V区段与J和D区段一起扩增，来评估这些扩增子中的任一种是否表现为克隆增殖。谱型分析方法的一个问题是许多不同的序列可能具有相同的长度而因此无法区分。因此，只有显著的克隆增殖才能通过谱型分析识别。需要改进自身免疫性疾病和自身免疫性疾病状态以及免疫系统在其中发挥核心作用的其他疾病的诊断和辅助预后的方法。尽管在免疫系统谱分析(profiling)中额外的特异性可能有利于更好地预测免疫系统对人类健康的影响，但是如果开发出方法，使得即使以前从未观察到那些特定序列也能鉴定出参与疾病过程的特定T细胞和B细胞，将具有更大的实用性。免疫系统的极大的多样性为其提供了可能有用的细胞的巨大储备，但同时也对尝试将这种组库(repertoire)用于预测性目的的研究人员提出了挑战。任意靶向于抗原的单一序列是可能参与给定个体的疾病过程和/或与之相关的广大序列中的一个。能确定给定个体的许多细胞中的哪些细胞参与疾病过程的方法将对人类健康具有很大价值。免疫细胞谱分析在癌症的诊断和治疗中也具有实用性。癌症的治疗经常涉及评估对治疗的响应以及监测疾病的复发。监测响应和癌症复发的最常用的方法是放射照相评估及血液生物标记。例如，在包括结肠癌在内的多种疾病中常用CT扫描来监测癌症的复发。同样，蛋白质生物标记，如PSA和CEA，是用于追踪前列腺癌和结肠癌的血液生物标记。特定基因组重排形成了另一种用于追踪癌细胞的引人注意的靶标。例如，在绝大多数慢性髓性白血病(CML)患者中存在的BCR-ABL易位已成为评估疾病状态的分析物。用PCR技术测定白血病细胞中的特异性易位及其顺从性允许产生高度特异性和灵敏性的检验，该检验现在常规用于监测CML患者。免疫细胞(或克隆型)谱分析可用于产生淋巴肿瘤的标记物。淋巴细胞谱系的癌症是一组多样化的临床疾病，这些疾病通常反映已转化为癌细胞的细胞的发育阶段。急性淋巴细胞性白血病(ALL)最常出现在未成熟的淋巴细胞中。另一方面，多发性骨髓瘤(MM)出现在已分化为产生抗体的浆细胞中。同样，不同类型的淋巴瘤通常反映了不同细胞发育阶段。这些疾病发生在不同的年龄群体中，具有不同的预后和死亡率，并可以采用不同的方案进行治疗。这些疾病通常采用化疗、放疗和/或骨髓移植进行治疗。随后根据具体临床情况通过不同的方法监测疾病的复发。这些方法包括使用标准血细胞计数及形态观察对血液和/或骨髓进行评估，使用细胞表面标记物的流式细胞术(FCM)，蛋白质电泳，以及分子技术，如PCR和FISH。此外，通常利用如CT和PET扫描的放射照相研究来监测某些淋巴癌的复发。这些方法具有侵袭性(骨髓)、高费用及辐射风险，和/或缺乏灵敏性。在一部分淋巴肿瘤中，存在对癌细胞具有特异性的某些分子标记，可用PCR以灵敏方式检测。例如，BCR-ABL存在于一部分ALL患者中，并且可作为监测肿瘤复发的标记物。遗憾的是，大多数患者不存在这类可灵敏且特异地检测复发的标记物。FCM可用于检测最小残留疾病(MRD)，其对预后用途是有用的。在这种使用多色流激活细胞分选(FACS)的技术中，可借助于癌细胞具有的特定细胞表面标记物来鉴定癌细胞。在专家操作下，该技术的灵敏度局限在< 10_4 (10，000个正常细胞中有I个癌细胞)，并且在某一时间点出现的标记物稍后可能会消失。因此，FCM通常无法用于在血液样品中检测早期复发。PCR提供了一种用于检测特定序列的灵敏性方法，且已将其用于检测癌细胞的B细胞受体(BCR)或T细胞受体(TCR)的特定重排。此技术利用了在针对不同淋巴细胞产生独特序列的不完美重组事件后产生了淋巴细胞中的B细胞受体或T细胞受体这一事实。例如，TCR是由TCRa链和TCRii链组成的。TCRa是通过将多个不同V区中的一个连接到多个J区中的一个而重组生成的。同样，TCRii是通过先后产生一个V、D和J区段的重组而生成的。在这两种情况下，重组通常不是完美的，而且一些碱基可能被从种系区段序列中删除，并且可能添加其他碱基(称为N碱基和P碱基)。V区段和J区段之间的序列被称为NDN 区。于是这些序列可作为这些淋巴细胞及其子代的标签。由于这些重组事件也发生在最终变为恶性的细胞中，所以B细胞受体和T细胞受体的独特序列可作为检测癌细胞的标签。标签序列是患者特异性的，而且实际上由于克隆进化，同一患者的标签序列也可能发生变化。为了从患者的白血病细胞中确定T细胞受体或B细胞受体的序列，使用通常白血病克隆高度富集的诊断白血病样品。例如，从诊断样品中扩增T细胞受体DNA和/或B细胞受体DNA，并将产物在凝胶上电泳，该凝胶可基于大小分离DNA (有时称为“谱型分析”);或者备选地，可进行异源双链体分析。观察到的大小分布的很大程度的偏移表示单克隆增殖，随后可以通过对偏移的分离峰处的样品进行测序对其进行证实。如果没有这种随后的测序，往往很难确定这种偏移是具有单克隆起源还是多克隆起源，例如Van Dongen等人的美国专利公开 2006/0234234。一旦确定了序列标签，就可以利用使用Taqman探针的实时PCR来监测该序列的水平。NDN区的长度一般不足以包括PCR引物以及检测用寡核苷酸。因此，通常使用与V区和J区互补的PCR弓丨物以及包括白血病克隆的某些NDN碱基的Taqman探针。这些弓I物提供了一定的特异性，因为他们只扩增了整个组库中的一部分。Taqman探针的杂交提供了针对特定克隆型的特异性。因此该本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.05.06 US 61/332,175;2010.10.25 US 61/455,743;1.一种监测患者中的疾病的方法，所述方法包括以下步骤: (a)通过从疾病相关组织中的淋巴细胞样品确定克隆型谱来鉴定ー种或多种与疾病相关的患者特异性克隆型，所述淋巴细胞样品包含来自所述疾病相关组织的克隆型的组库；和 (b)从外周血细胞样品确定克隆型谱来鉴定ー种或多种与疾病相关的患者特异性克隆型的存在、不存在和/或水平，该外周血细胞样品包含克隆型的组库。2.权利要求1的方法，进ー步包括重复所述步骤(b)以监测患者中的疾病或病状的步骤。3.权利要求1的方法，其中所述鉴定步骤进一歩包括从同一患者中的非疾病相关组织中的淋巴细胞样品确定克隆型谱，并将该克隆型谱与来自所述疾病相关组织的克隆型谱进行比较，以鉴定所述ー种或多种患者特异性克隆型。4.权利要求3的方法，其中所述疾病 相关组织是来自所述疾病的高峰状态的组织，并且其中所述非疾病相关组织是来自所述疾病的非高峰状态的组织。5.权利要求4的方法，其中所述疾病是自身免疫性疾病。6.权利要求5的方法，其中所述自身免疫性疾病是系统性红斑狼疮，所述疾病相关组织是肾、皮肤、外周血或骨髄；所述自身免疫性疾病是多发性硬化症，所述疾病相关组织是脑脊液；或者所述自身免疫性疾病是类风湿关节炎，所述疾病相关组织是滑液。7.权利要求5的方法，进ー步包括重复所述步骤(b)以监测患者中的疾病或病状的步骤。8.权利要求1的方法，其中所述疾病是淋巴瘤，所述疾病相关组织是骨髓或淋巴组织；或者所述疾病是白血病，所述疾病相关组织是骨髓或外周血。9.权利要求8的方法，进ー步包括重复所述步骤(b)以监测患者中的疾病或病状的步骤。10.权利要求8的方法，其中所述鉴定步骤进一歩包括从同一患者中非疾病相关组织中的淋巴细胞样品确定克隆型谱，并将该克隆型谱与来自所述疾病相关组织的克隆型谱进行比较，以鉴定所述ー种或多种患者特异性克隆型。11.权利要求1的方法，其中所述鉴定步骤进一歩包括从同一患者中非疾病相关组织中的淋巴细胞样品确定克隆型谱，并将该克隆型谱与来自所述疾病相关组织的克隆型谱进行比较，以鉴定所述ー种或多种患者特异性克隆型。12.权利要求11的方法，进ー步包括重复所述步骤(b)以监测患者中的疾病或病状的步骤。13.权利要求11的方法，其中根据在所述疾病相关组织中与在所述非疾病相关组织中具有不同的频率；或者根据在所述疾病相关组织中与在所述非疾病相关组织中具有不同程度的基于IgH的克隆型中的体细胞超突变；或者根据在所述疾病相关组织中与在所述非疾病相关组织中具有不同的V区和J区使用频率；或者根据在所述疾病相关组织中与在所述非疾病相关组织中具有不同平均长度的NDN区；或者根据在所述疾病相关组织中与在所述非疾病相关组织中具有不同的BCR和/或TCR表达水平；或者根据在所述疾病相关组织中与在所述非疾病相关组织中具有不同数量的编码相同或相似蛋白质的克隆型，来鉴定所述ー种或多种患者特异性克隆型。14.权利要求13的方法，进一步包括重复所述步骤(b)以监测患者中的疾病或病症的步骤。15.权利要求13的方法，其中根据在所述疾病相关组织中比在所述非疾病相关组织中具有更高的频率来鉴定所述一种或多种患者特异性克隆型。16.权利要求13的方法，其中根据在所述疾病相关组织中与在所述非疾病相关组织中具有不同的V区和J区使用频率来鉴定所述一种或多种患者特异性克隆型。17.权利要求13的方法，其中根据在所述疾病相关组织中与在所述非疾病相关组织中具有不同平均长度的NDN区来鉴定所述一种或多种患者特异性克隆型。18.权利要求13的方法，其中根据在所述疾病相关组织中与在所述非疾病相关组织中具有不同的BCR和/或TCR表达水平来鉴定所述一种或多种患者特异性克隆型。19.权利要求1的方法，其中通过将确定的克隆型与已知与所述疾病相关的克隆型进行匹配，或者通过将V区和J区使用与已知与所述疾病相关的V区和J区使用的频率进行匹配，来鉴定所述一种或多种患者特异性克隆型。20.权利要求19的方法，其中所述匹配包括发现由所述确定的克隆型所编码的氨基酸序列与由已知与所述疾病相关的克隆型或其基本上相同的变体所编码的氨基酸序列之间的同一'I生。21.权利要求19的方法，其中所述匹配包括发现所述确定的克隆型与已知与所述疾病相关的克隆型或其基本上相同的变体的核酸序列之间的同一性。22.权利要求19的方法，其中所述匹配包括发现所述确定的克隆型与已知与所述疾病相关的克隆型或其基本上相同的变体的核酸序列之间的同一性。23.权利要求1的方法,其中所述组库中的每一个有99%的概率包括以0.01%或更高的频率存在的每种克隆型。24.权利要求1的方法，其中所述组库中的每一个包括至少含IO4个克隆型的样品。25.权利要求1的方法，其中所述组库中的每一个包括至少含IO5个克隆型的样品。26.权利要求1的方法，其中所述疾病选自淋巴增生性疾病、实体瘤、感染性疾病和自身免疫性疾病。27.权利要求26的方法，其中所述从所述血细胞样品确定所述组库的步骤进一步包括包含任何以前未记录的所述一种或多种患者特异性克隆型的系统发生克隆型作为所述一种或多种患者特异性克隆型。28.权利要求26的方法，其中所述系统发生克隆型包括与所述一种或多种患者特异性克隆型中的任一种90%相同的以前未记录的克隆型。29.权利要求26的方法，其中所述系统发生克隆型包括通过体细胞超突变与所述一种或多种患者特异性克隆型相关的以前未记录的克隆型。30.权利要求26的方法，其中所述疾病是淋巴增生性疾病，并且其中所述系统发生克隆型包括通过体细胞重排与所述一种或多种患者特异性克隆型相关的以前未记录的克隆型。31.权利要求30的方法，其中所述体细胞重排包括VH替代。32.权利要求30的方法，其中所述体细胞重排包括与所述一种或多种患者特异性克隆型中的任一种具有相同突变的V区和J区但是与该患者特异性克隆型具有不同的NDN区的克隆型。33.权利要求27的方法，其中所述鉴定步骤进一步包括从同一患者中非疾病相关组织中的淋巴细胞样品确定克隆...

【专利技术属性】
技术研发人员：马利克·法哈姆，托马斯·威利斯，
申请(专利权)人：赛昆塔公司，
类型：
国别省市：