本发明专利技术公开了一种由以下重量百分比的原料组成的壳聚糖纳米粒：壳聚糖0.5-5％、助溶剂1-10％、防冻剂0-5％、表面活性剂0.1-1％、乳化剂0.1-0.5％、缓冲液40-60％、余量为水。还提供了一种防治松材线虫的生物农药制剂及其制备方法，其主要由以下重量百分比的成分组成：(A)0.05-15％的有效成分：针对松材线虫高效致死靶基因设计合成siRNA，所述siRNA为15-50nt的双链RNA、(B)19.95-55％溶剂、(C)30-80％所述的壳聚糖纳米粒。所述壳聚糖纳米粒使生物农药制剂的稳定性、防治松材线虫效果更好。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于农用杀虫剂
，具体涉及一种生物农药制剂及其制备方法，特别一种壳聚糖纳米粒、含有双链核糖核酸的防治松材线虫的生物农药制剂及其制备方法。
技术介绍
松材线虫[BursaphelenchusxylophiIus(Steiner & Buhrer 1934)Nikle1970,同物异名:Aphelenchoides xylophilus Striner & Buhrer Bursaohelenchuslignicol-US Mamiya&Kiyohara]引起松树萎蔫病(Pine Wilt Disease)是林业生产的一大重要病害，被誉为松树的癌症。可危害57种松属(Pinus)植物及雪松属(Cedrus)、冷杉属(Abies)、云杉属(Picea)、落叶松属(Larix)和黄杉属(Pseudotsuga)等14种非松属针叶树。树木感染松材线虫病后一般2-3个月内死亡。该害虫的传播介体昆虫主要是松墨天牛(Monochamus alternatus)。目前国内外对松材线虫的控制主要包括化学防治、物理熏蒸、机械防治、生物防治、林分改造、育种等，防治对象主要针对媒介松墨天牛和松材线虫病原本身。虽然有效控制了害虫的蔓延，减少了损失。但是，松材线虫病的防治仍面临许多问题。虽然多数人工药剂具有毒性强、见效快等优点，但都不可避免地会带来一些负面效应，如易残留，对环境造成破坏。长期重复使用容易使病虫产生抗性，从而出现再猖獗。熏蒸和机械防治耗费太多人力，成本较高(每亩人工费用高达4500元人民币)，加之远山深山交通极为不便等，所以熏蒸和机械防治不能大规模控制松材线虫病的发生和蔓延。释放和招引天敌、改造林区结构、育种等措施虽然环保、可持续、有效，但是周期太长，短期内很难见成效。所以尽管我国广大森林病虫害防治工作者在松线虫防治方面做了很大的努力，但是松材线虫的扩散蔓延趋势仍未得到根本性的扭转，发生形势依然十分严峻。根据上述世界性林业有害线虫的防治形势分析，高效、环保、不诱导抗性天然化合物对松材线虫的生物防治显得十分重要。因此，寻找具有新机制、高活性、不诱导抗性物质成为今后的发展趋势。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指外源或者内源的双链RNA特异性地引起基因沉默的现象，是2006年Fire和Mello诺贝尔奖技术，现在被植物学家作为线虫防治的成功技术(Yadav BC, et al.2006 ；Huang G, et al.2006 ；Sindhu AS, et al.2009 ；SindhuAS,et al.2009)。该现象首先在秀丽隐杆线虫中发现，后来被证明广泛存在于真核生物中，目前大量用于线虫的基因组功能研究，包括检疫性松材线虫(Rosso MN,et al.2005 ；UrwinPE,et al.2002 ；Vanholme B,et al.2007 ；Dalzell JJ,et al.2010 ；Park JE,et al.2008 ；Cheng XY, et al.2010 ；Kang JS, et al.2011 ；Li X，et al.2011)。大量实验证明，线虫对基因沉默较其他生物物种更加敏感(May RC，Plasterk RH 2005)。RNA干扰技术在线虫防治方面取得的突破性进展为线虫的防治奠定了理论基础，提供了一种新的线虫防治策略，开辟了作物保护新局面。虽然基因沉默技术开启了线虫防治的新篇章，该技术手段对松材线虫的杀灭作用已被证明，但是目前大量的尝试仅限于实验室范围，还未实现实际操作应用。限制该技术广泛应用的因素主要是:(一)没有开发出能增强dsRNA有效成分稳定性、维持其杀虫效果、适合规模化应用的成熟稳定的先进农药制剂；(二)没有探究出简单便捷、具可操作性的规模化生产工艺。先进农药制剂的标志是高效、环境友好和控释。高效取决于有效成分本身和它在剂型中的微粒尺寸，尺寸越小，表面积越大，效率就越高。水基化农药制剂如水剂、乳化剂、水乳剂、悬浮剂、悬乳剂等被认为是环境友好剂型，其农药的微粒尺寸由纳米到微米依次增大，但都不具有控释作用。为了减小农药的尺寸和实现缓释，文献报到将农药制成纳米晶粒，或者在纳米粒外部用合成高分子涂敷，或将液体农药包括成微胶囊，以及用多入口旋涡混合器将联苯菊酯制成纳米颗粒，用海藻酸钠和壳聚糖通过层层组装将吡虫啉包裹等，但这些方法烦琐，并不简单，不易进行大规模生产。壳聚糖纳米粒作为一种新型药物载体，在医学上已成为国内外研究开发的热点。邬思辉(2009)等将壳聚糖制成纳米粒负载胰岛素，控制药物释放、延长药物疗效、降低药物毒副作用，可以提高疏水性药物对细胞膜的通透性和药物稳定性及改变给药途径，还可以加强制剂的祀向给药能力。刘慧(2007)等研究壳聚糖纳米粒的制备并检测其性能,希望得到一种能在黏膜给药体系应用的药物载体，从而实现抗菌药物的持续释放，达到长期疗效的目标。苏丹(2007)等以壳聚糖纳米粒为载体负载siRNA穿过细胞膜，进入细胞质中的RNAi通路，为人类疾病发生机理、疾病基因治疗靶点的鉴别以及新药研发如小分子化合物和抗体类药物的发现提供理论依据，但其研究仅适合医学而不使用于农药研究。壳聚糖纳米粒在医学上的应用已多有报道，但是在农业上的应用报道还不多见。林春梅(2009)等利用壳聚糖带阳离子的特性，使其与带阴离子的三聚磷酸钠发生离于交联，包裹部分阿维菌素颗粒后形成纳米载药颗粒。赵书言(2009)等用壳聚糖纳米粒包埋尿素，使得尿素的释放速度减慢，增强缓释效果。冯博华(2009)等以蓖麻油酸钠和壳聚糖为原料制备纳米粒子包裹鱼藤酮、印楝素植物源农药，避免了大量有机溶剂和助剂的使用。李敏(2011)等通过过氧化氢降解壳聚糖制备低聚物，以吡虫啉、毒死蜱为模型药物，研究纳米粒子的理化性质及不同制备方法形成机理。张子勇(2012)等以壳聚糖和羧甲基壳聚糖为载体，制备印楝素纳米粒子水分散液。尽管上述报 道成功制备了农药壳聚糖纳米粒制剂，但是其研发均处于探究阶段，所制备的纳米粒尺寸、粒径分布、药物负载率等理化指标均不稳定，未实现标准化水平，其次工艺烦琐，不易实现规模生产，所以至今局限于实验室研究，并未见转化为产品制剂流通市场。此外，目前成功报道的农药壳聚糖制剂包埋的农药有效成分多为现存化学农药，分子量小，技术操作相对简单。本专利技术基于上述现状，专利技术出首例基于基因沉默技术的防治松材线虫的生物农药制剂，同时利用一种简捷、规模化的制备方法，研制出适用于有效成分dsRNA大分子的壳聚糖纳米粒助剂。本专利技术生物农药制剂不仅能高效防治松材线虫，而且能体外保持dsRNA稳定性，增强其杀虫效果。本专利技术制剂是一种高效、环境友好和控释的先进农药制剂。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种适用于生物农药制剂的有效成分siRNA的大分子的壳聚糖纳米粒。实现上述目的的技术方案如下:一种壳聚糖纳米粒，其由以下重量百分比的原料组成:壳聚糖0.5-5%、助溶剂1_10%、防冻剂0-5%、表面活性剂0.1_1%、乳化剂0.1-0.5%、缓冲液40-60%、余量为水。优选地，壳聚糖纳米粒中的助溶剂用于增加壳聚糖的溶解性，为聚乙二醇200、聚乙二醇400、乙醇、丙本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种壳聚糖纳米粒，其特征是，其由以下重量百分比的原料组成：壳聚糖0.5?5％、助溶剂1?10％、防冻剂0?5％、表面活性剂0.1?1％、乳化剂0.1?0.5％、缓冲液40?60％、余量为水。
【技术特征摘要】
1.一种壳聚糖纳米粒，其特征是，其由以下重量百分比的原料组成: 壳聚糖0.5-5 %、助溶剂1-10 %、防冻剂0-5 %、表面活性剂0.1-1 %、乳化剂0.1-0.5%、缓冲液40-60%、余量为水。2.根据权利要求1所述的壳聚糖纳米粒，其特征是，所述助溶剂为聚乙二醇200、聚乙二醇400、乙醇、丙二醇中的一种或者几种混合物。3.根据权利要求1所述的壳聚糖纳米粒，其特征是，所述防冻剂为丙三醇、乙二醇、异丙醇、二甘醇中的一种或者几种混合物。4.根据权利要求1所 述的壳聚糖纳米粒，其特征是，所述表面活性剂为吐温20、吐温40、吐温60、吐温80中的一种或者几种混合物。5.根据权利要求1-4任一项所述的壳聚糖纳米粒，其特征是，所述乳化剂为三聚磷酸钠、苄基二甲基酚聚氧乙烯醚、烷基苯磺酸钙、苯乙基酚聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚甲醛缩聚物、苯乙基酚聚氧乙烯聚氧丙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚磷酸酯、苯乙基聚氧乙烯醚硫酸铵盐、烷基联苯醚二磺酸镁盐中的一种或者几种混合物；所述缓冲液为醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液的一种或者几种混合物。6.一种防治松材线虫的生物农药制剂，其特征是，其主要由以下重量百分比的成分组成: (A)0.05-15%的有效成分:针对松材线虫高效致死靶基因设计合成siRNA，所述siRNA为15-50nt的双链RNA、(B)19.95-55%溶剂、 (C)30-80%权利要求1-5任一项所述的壳聚糖纳米粒。7.根据权利要求6所述的防治松材线虫的生物农药制剂，其特征是，所述松材线虫高效致死靶基因为乙酰胆碱酯酶基因、G蛋白基因、电子转移黄素蛋白基因、钙网蛋白基因。8.根据权利要求7所述的防治松材线虫的生物农药制剂，其特征是，所述针对乙酰胆碱酯酶基因的 siRNA 为 SEQ ID N0.1 及 SEQ ID N0.2,SEQ ID N0.3 及 SEQ ID N0.4,SEQ IDN0.5 及 SEQ ID N0.6...
【专利技术属性】
技术研发人员：张必良，
申请(专利权)人：广州市锐博生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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