本发明专利技术涉及一种具有植物免疫激活作用的软腐欧文氏菌、从其中提取的免疫激活蛋白及其应用。该软腐欧文氏菌于2012年8月15日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo.6433。本发明专利技术得到的软腐欧文氏菌能够诱导植物本身产生抗性反应，对植物起到免疫激活作用。经验证，该软腐欧文氏菌中起免疫激活作用的物质是其产生的一种蛋白，将其命名为EccPR蛋白，该蛋白用于植物免疫激活，能使植物体内抗性基因表达明显提高，从而有效地诱导植物对病原菌起到抗性作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种具有植物免疫激活作用的软腐欧文氏菌、从其中提取的免疫激活蛋白及其应用。
技术介绍
我国是当今世界首屈一指的农业大国，但由于多方面的原因，重大病害出现的频率和面积明显增加，造成的产量损失都在10%左右。河北省主要农作物、经济作物如小麦、玉米、棉花等和大棚蔬菜每年因病虫害的损失也是巨大的，据估计可达数十亿元。为了对付严重的农作物病害，农业生产者大量使用化学农药。化学农药的施用也确实对农作物病害的控制做出了巨大的贡献。但是，化学农药的大量施用也正在显示着严重的负面影响。因此，在全球范围内研究、开发和生产安全、无毒副作用、对环境友好的生物制剂成为新产业的发展重点。随着生物防治、绿色农业等呼声日益高涨，植物抗病免疫技术的研究成为近年兴起的重要研究领域。植物免疫抗病激活剂是一些生物和非生物因子，能够诱导植物独特的生理状态，植物能够更好或更快或者既好又快的调配防卫反应的生理状态，使植物防御病虫害的状态处在临界，达到一触即发，当病害在侵染植物时，植物会在短时间内借助于诱导因子激发植物整体的抗性水平，调动整个植物的免疫能力，激活植物自身抗病相关基因的表达，抵抗病原物的侵染，自身不对病原菌起作用，不会使病原菌产生抗药性，用量低、高效、诱导的植物抗病谱广、抗病持续时间长，这对于植物病害的可持续控制具有重要的意义。软腐欧文氏菌是一种广泛的致病菌，主要发生在大白菜、卷心菜、菜花、马铃薯等作物上，主要为害叶、茎及块茎。叶染病近地面老叶先发病，病部呈不规则暗褐色病斑，湿度大时腐烂。茎部染病多始于伤口，再向茎干蔓延，后茎内髓组织腐烂，具恶臭，病茎上部枝叶萎蔫下垂，叶变黄。块茎染 病多由皮层伤口引起，初呈水浸状，后薯块组织崩解，发出恶臭。
技术实现思路
本专利技术的目的提供一种具有植物免疫激活作用的软腐欧文氏菌、从其中提取的免疫激活蛋白及其应用。本专利技术采取的技术方案 一种具有植物免疫激活作用的胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种份carotovora subsp. Carotovora strain Ecc 601,于 2012 年 8 月 15 日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No. 6433。所述的软腐欧文氏菌Erwinia carotovora subsp. Carotovora strain Ecc 601中提取的免疫激活蛋白，其提取方法如下(I)将 min1-Tn5_Km 转座子插入软腐欧文氏菌 Erwinia carotovora subsp.Carotovora strain Ecc 601中，筛选出不能使烟草叶片出现过敏反应即叶片上出现坏死斑的突变菌； (2)利用转座子min1-Tn5-Km上的Km标签，通过RACE-PCR扩增上述突变菌中转座子插入点两端的DNA片段，经过测序拼接后，获得DNA序列； (3)将步骤(2)得到的DNA序列连接到pET30a(+)上，并将其转入到大肠杆菌E.coliBL21 中，获得工程菌 E. coli BL21 (pET30a_EccPR); (4)将工程菌Ε·coli BL21 (pET30a-EccPR)诱导培养获得具有植物免疫激活作用的免疫激活蛋白。所述的免疫激活蛋白的应用。本专利技术的有益效果本专利技术得到的软腐欧文氏菌能够诱导植物本身产生抗性反应，对植物起到免疫激活作用。经验证，该软腐欧文氏菌中起免疫激活作用的物质是其产生的一种蛋白，将其命名为EccPR蛋白，该蛋白用于植物免疫激活，能使植物体内抗性基因表达明显提高，从而有效地诱导植物对病原菌起到抗性作用。具体实施例方式本专利技术筛选得到一种具有植物免疫激活作用的软腐欧文氏菌^nrifliacarotovora subsp. Carotovora strain Ecc 601,该菌株作为病原菌侵染拟南芥时,不能使拟南芥染病，而且将这种菌接种于烟草叶片，烟草叶片能够过敏反应，出现坏死斑。本专利技术从软腐欧文氏菌iZnfiflia car ο tovora subsp. Caro tovora strain Ecc601中提取EccPR蛋白的过程如下 (1)将min1-Tn5_Km 转座子插入软腐欧文氏菌 Erwinia carotovora subsp.Carotovora strain Ecc 601 中获得突变菌种库,筛选出不能使烟草叶片出现过敏反应的突变菌carotovora subsp. Carotovora strain Ecc 仰27淑，即在该菌株中转座子的插入破坏了软腐欧文氏菌份carotovora subsp. Carotovora strain Ecc 601中能使植物对病原菌产生抗性的功能单元的结构； (2)利用转座子min1-Tn5-Km上的Km标签，通过RACE-PCR扩增转座子插入点两端的DNA片段，经过测序拼接后，获得DNA序列； (3)将步骤(2)得到的DNA序列连接到pET30a(+)上，并将其转入到大肠杆菌E.coliBL21 中，获得工程菌 E. coli BL21 (pET30a_EccPR); (4)将工程菌Ε·coli BL21 (pET30a-EccPR)诱导培养获得具有植物免疫激活作用的免疫激活蛋白EccPR，其具体过程为 将工程菌E. coli BL21 (pET30a-EccPR)单菌落挑起于LB培养基中在37°C下进行过夜培养，将其作为母种，第二天将母种以1%接种量接种于液体LB培养基中，在37°C下进行培养5-7小时，在其培养液中加入0. 4mM的IPTG进行诱导培养，诱导6_8小时后，将该培养液进行离心，获得的菌体然后将其水悬浮并煮沸10-15分钟，离心后将上清冷冻干燥，获得含有70-80%发酵免疫激活蛋白EccPR的粗蛋白，如果要获得纯免疫激活蛋白EccPR，则将其过层析柱即可得到纯品免疫激活蛋白EccPR。本专利技术得到的EccPR蛋白在诱导植物产生抗病性中应用 将浓度为lmg/ml的EccPR免疫激活蛋白溶液分别喷施到拟南芥、黄瓜和烟草上，每7天喷施一次，每次喷施蛋白总量为20-25mg/株，总共喷施3次。最后一次喷施20天后，分别在拟南芥上接种丁香假单胞杆菌DC3000，在黄瓜上接种枯萎病菌，在烟草上接种软腐欧文氏菌 Erwinia carotovora subsp. Carotovora strain Ecc。同时用不喷施 EccPR 免疫激活蛋白溶液的植物个体做对照。培养72小时后，发现在没有喷施激活蛋白EccPR的植物上都染病，而喷施的植物上染病率是20%，而且这些染病的植物都产生了过敏反应。用激活蛋白EccPR处理过的植物叶片中的病原菌数目比未处理的降低了 45%，而且相应的抗性基因表达都有明显的提高PR1提高7. 3倍，PR5提高1. 8倍，PDF1. 2提高11. 7倍，Thi2.1提高21.1倍，VSP2.1提高43. 4倍。这些说明EccPR免疫激活蛋白是一种有效的诱抗剂，能够有效的诱导植物对病原菌起到抗性作用，而且这种使用方法能够最佳诱导植物产生抗性。EccPR蛋白还具有促进种子萌发和促进植物生长的作用 将免疫激活蛋白EccPR纯品溶解在水中，分别配制不同浓度的溶液，溶液浓度分别为O. O lm本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有植物免疫激活作用的软腐欧文氏菌Erwinia?carotovora?subsp.?Carotovora?strain?Ecc?601，其特征在于其于2012年8月15日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC?No.?6433。
【技术特征摘要】
1.一种具有植物免疫激活作用的软腐欧文氏菌Erwinia carotovora subsp.Carotovora strain Ecc 601,其特征在于其于2012年8月15日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No. 6433。2.由权利要求1所述的软腐欧文氏菌Erwiniacarotovora subsp. Carotovorastrain Ecc 601中提取的免疫激活蛋白，其特征在于其提取方法如下 (1)将min1-Tn5_Km 转座子插入软腐欧文氏菌 Erwinia carotovora subsp.Carotovora stra...
【专利技术属性】
技术研发人员：贾振华，宋水山，刘方，马宏，赵芊，黄亚丽，
申请(专利权)人：河北省科学院生物研究所，
类型：发明
国别省市：
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