本发明专利技术公开了似VBNC的可培养乳酸杆菌，是新近研究发现的又一种活的细菌存在形式，是VBNC细菌突变体，在进入VBNC状态后，具备了VBNC细菌相关基因，不经过细菌活的非可培养状态的复苏方法复苏，用常规方法就可培养。其中植物乳杆菌的VBNC细菌突变体于2012年9月18日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心。弥补了VBNC细菌不能生长繁殖和无法保存的缺憾；作为VBNC细菌模型用于研究VBNC的发生机制，及以乳酸菌为载体、研制口服疫苗等方面具有广阔的前景，并对VBNC乳酸杆菌及其突变体对断奶仔猪的免疫学活性进行测定，从而为进一步研制新型猪用微生态制剂奠定基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种活的细菌存在形式，确切地说是似活的非可培养状态的可培养乳酸杆菌。
技术介绍
众所周知，目前普遍使用的动物微生态活菌制剂主要是以乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌等多种益生菌研制的，其中应用最广泛、种类最多的是以乳酸杆菌为主的活菌制剂。但由于乳酸杆菌不耐热，经受不住饲料制粒与膨化过程中高温高压的破坏作用，因而许多专家极力建议应直接饲喂。然而，用于直接饲喂的活菌制剂产品最重要的标志是活菌数量，规定合格产品中的活菌数应达到IO9 CFU/g，因而有效活菌数的多少和保存期的长短就成了产品货架寿命的关键指标。当前市售的该类产品主要用冻干技术保持活菌活力，但生产成本较高。一般含有IO9个活菌数的冻干粉价格约1000元/Kg，而含有101°个活菌数的价格则为两倍。尽管采用稳定化、微胶囊化及包膜等先进工艺替代，也克服不了高成本、繁制备等缺点。由此反映出动物微生态产业中存在的主要问题，一是基础研究问题，主要涉及微生物菌种的筛选与鉴定；二是产业化问题，主要涉及产品的制剂技术。而其核心问题只有一个，即保持微生物活性、提高微生物活力、延长微生物保存。自1982年细菌活的非可培养状态(viable but noncultutable, VBNC)发现以来， 独特的生物学特征不仅让更多的人认识到VBNC病菌的巨大危害，同时也会让研究者看到 VBNC益生菌的实际应用价值，即VBNC益生菌可由寡营养、低温等不利条件诱导，可以相当长时间内保留原菌生物学特征。尽管丧失了平板上生长繁殖能力，但却可以长久存活。此状态下的细菌均可启动全部促进生存和抵御不良环境的基因群，就是这些基因群的表达产物维持着菌体活性。摆在现阶段的一个瓶颈问题是VBNC维持期内的细菌，其生物学性质难以稳定存在，极易在研究过程中突然消失，使细菌转入真正死亡期，而且进入VBNC状态的细菌常规的培养方法不可培养。只有采用特殊的方法复苏后，才可培养。
技术实现思路
本专利技术的目的是为解决VBNC维持期内的细菌，其生物学性质难以稳定存在，极易在研究过程中突然消失，保存期短的问题，而提供一种耐寡营养、低温等不利条件，进入 VBNC状态后，用常规的培养方法既可培养的，能稳定繁殖遗传的VBNC细菌突变体，似活的非可培养状态的可培养乳酸杆菌。似VBNC的可培养乳酸杆菌，保藏编号为CGMCC No. 6579。所述的VBNC的可培养乳酸杆菌，是从自然发酵酸牛奶中分离出来的植物乳酸杆菌 LactobaciIlus plantarum,似VBNC的可培养乳酸杆菌的鉴定方法，用常规的方法诱导乳酸杆菌进入VBNC状态，可培养的即为似VBNC的可培养乳酸杆菌；所述的可培养是不经过VBNC的复苏，用常规方法既可培养。似VBNC的可培养乳酸杆菌作为VBNC细菌模型用于研究VBNC细菌的应用。细菌VBNC状态是指细菌在不良环境中，细胞缩成球形，用常规方法(平板法、最大可能近似值法)培养时，不能生长繁殖，但仍然是活的细菌的特殊存在形式。不可培养是指用常规的方法不可培养；可培养是指用常规的方法既可培养。目前将正常的细菌经过诱导进入VBNC状态，及检测其是否进入VBNC状态的技术手段已经很成熟，寡营养、低温等不利条件均能诱导细菌进入VBNC状态。细菌活的非可培养状态(Viable but Non-culturable, VBNC)的复苏是指将不能培养的细菌恢复为可培养状态的过程，国内外用于VBNC沙门氏菌复苏的方法主要源自于 Reissbrodt 等人在 2002 年发表在 Applied and Environmental Microbiology 刊物上的一篇题为((Resuscitation of Salmonella ent erica Serovar Typhimurium and Enterohemorrhagic Escherichia coli from the Viable but Nonculturable State by Heat-Stable Enterobacterial Autoinducer》的文章。文中提及的VBNC沙门氏菌复苏所需主要材料为含有30%牛血清和50ymol/L去甲肾上腺素的SAPI培养基，其中SAPI培养基成份较为复杂。通过此法可以使维持VBNC长达I年的细菌恢复为可培养状态。本专利技术人多年从事VBNC细菌的研究，新近研究发现了又一种活的细菌存在形式， 有些VBNC细菌突变体，在进入VBNC状态后，具备了 VBNC细菌相关基因，不经过细菌活的非可培养状态(Viable but Non-culturable, VBNC)的复苏，用常规方法培养，即可培养。这些突变体与VBNC细菌具有相同的特征，但又有别于VBNC细菌，命名为似VBNC的可培养细菌。获得了多株VBNC细菌突变体，其中植物乳杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的VBNC细菌突变体于2012年9月18日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心。弥补了 VBNC细菌不能生长繁殖和无法保存的缺憾，在不良环境中能持续存活的 “菌种”。解决了微生态制剂产业中存在的核心问题。在作为VBNC细菌模型用于研究VBNC 细菌，研究VBNC的发生机制，及以乳酸菌为载体，研制口服疫苗等方面，本研究对乳酸杆菌实施化学诱变，经VBNC诱导条件筛选，以及AFLP鉴定后获得VBNC乳酸杆菌突变体，并对 VBNC乳酸杆菌及其突变体对断奶仔猪的免疫学活性进行测定，从而为进一步研制新型猪用微生态制剂奠定基础。附图说明图1选择性扩增产物PAGE检测，M :分子量标记；1 :阴性对照；2 :乳酸杆菌；3 :似 VBNC的可培养乳酸杆菌；图2早期断奶仔猪平均体重变化；图3不同时期内断奶仔猪血清中IL-1O含量；图4不同时期内各组断奶仔猪血清中TNF-α含量。具体实施方式 实施例1植物乳酸杆菌化学诱变乳酸杆菌(L)是吉林农业大学预防兽医学实验室从自然发酵酸牛奶中分离，经16sRNA 鉴定为植物乳酸杆菌plantarum)0由吉林农业大学预防兽医学实验室保存。I)似活的非可培养状态的可培养乳杆菌MVR株的获得。实验组取5 X IO8个/ml的乳酸杆菌(L)菌体悬浮液lml，加入100 μ I NTG (lmg/ ml)，充分混合后，在30°C条件下作用30min，反应结束后用O.1M磷酸缓冲液[pH7. O]终止反应，NTG用量以致死率达到80% 95%为宜。对照组未经NTG处理的乳酸杆菌(L)悬浮液。实验组、对照组的菌液进行10倍稀释，涂布于MRS固体培养基中，37°C培养。将单菌落接种到100ml的液体MRS中，振荡培养至0D_接近O. 8时，取Iml菌液至pH 2. O 3. 0，MRS液体培养基中，4°C兼性厌氧培养。在VBNC诱导过程中，取经NTG 和未经NTG处理的菌液涂布于固体MRS中，37°C培养，未经NTG处理的乳酸杆菌作为对照组在35d内可培养菌数显著下降，连续培养3d，无细菌生长，按专利200810051106. 9提供方法检测，即取待检菌液50 μ 1，加入SYT09和PI各 25μ 1，吹吸混匀，避光染色15 20min。然后将经墨水染黑的微孔滤膜置于无自发荧光的载玻片上，吸取适量菌体滴在微孔滤膜上，待液体刚好被滤膜吸干时本文档来自技高网...
【技术保护点】
似VBNC的可培养乳酸杆菌，保藏编号为CGMCC??No.6579。
【技术特征摘要】
1.似VBNC的可培养乳酸杆菌，保藏编号为CGMCCNo. 6579。2.根据权利要求1所述的似VBNC的可培养乳酸杆菌，是从自然发酵酸牛奶中分离出来的植物乳酸杆菌。3.似VBNC的可培养乳酸杆菌的鉴定方法，用常规的方法...
【专利技术属性】
技术研发人员：李影，钱爱东，段锐，段冶，王立新，张宇，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：
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