本发明专利技术提供一种检测人杯状病毒的三重荧光定量RT-PCR试剂盒，由定量RT-PCR反应液管、酶混合液管、引物探针混合液管、阴性对照品管、三个标准品管、三个阳性对照品管和盒体组成。标准品为GI型诺如病毒、GII型诺如病毒和札如病毒标准品。对照品为阳性和阴性对照品。本发明专利技术试剂盒根据GI型诺如病毒、GII型诺如病毒和札如病毒的保守区序列设计特异性的引物和探针，采用一步法三重实时荧光定量RT-PCR技术，可以从标本中准确检测出GI型诺如病毒、GII型诺如病毒和札如病毒。试剂盒设计合理，操作简便、快速和准确。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属生物
，涉及一种检测荧光定量RT-PCR试剂盒，具体涉及一种一步法检测人杯状病毒的三重实时荧光定量RT-PCR试剂盒。
技术介绍
人杯状病毒(Human calicivirus, HuCVs)是引起儿童和成人非菌性急性腹湾的主要病原之一，仅次于轮状病毒。它传染性强，在世界各地广泛传播，尤其是对婴幼儿健康影响较大。最早发现的人杯状病毒是由美国学者Kapikin于1972年采用免疫电镜方法从俄亥俄州诺瓦克地区一所学校暴发的胃肠炎病人粪便标本中检出，并以发现地将其命名为诺瓦克病毒。此后，人杯状病毒在世界各地不断被发现，根据病毒形态结构、抗原特性、宿主范围和所致疾病的临床症状，以及病毒基因组序列和和遗传进化分析的结果进行病毒分类，2002年8月第八次ICTV确定人杯状病毒包括两个属诺如病毒属(Norovirus，NV)和札如病毒属(sapovirus, SV)。诺如病毒毒株间具有很大核苷酸序列多样性，依据基因结构ORFl和0RF2之间的差异，诺如病毒分为5个基因组(G1-GV)，其中GI (以nonvalk-like virus为代表)和GII (以Snow Mountain virus为代表)是感染人类的两个最常见的基因组。札如病毒即札幌病毒，为单股正链RNA病毒，其原型毒株最早为1977年日本学者Chiba等从札幌某托儿所一系列的腹泻爆发研究中所证实。此类病毒所致疾病主要与人和动物的胃肠炎有关，不同年龄段人群都可感染，引起腹泻，主要以婴幼儿最为易感。札如病毒主要经粪-口途径传播，在有些地区，札如病毒逐渐成为仅次于诺如病毒引起病毒性腹泻的主要病因。由于人杯状病毒不 能进行细胞和组织培养，其检测方法的发展受到了很大限制。传统的杯状病毒检测方法主要有电镜、放射免疫试验、酶免疫试验等，但这些方法均不够敏感。随着基因组测序技术的进展，据此建立的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测人杯状病毒，使得检测灵敏度大大提高。目前的方法学检测中，RT-PCR方法已成为检测人杯状病毒最敏感、也是应用最广泛的方法。实时荧光定量PCR技术具有全封闭单管扩增、简便快捷、重复性好、实时定量、污染少等优势，克服了以往临床诊断的缺陷，具有高度的特异性和敏感性，为临床诊断提供了准确可靠的实验室依据，可作为一种临床病原诊断的有效、快速的检测手段。但是单管实时荧光定量RT-PCR检测一种病原，不仅耗时耗力，也浪费试剂耗材，因而建立可同时检测多种病原的多重实时荧光定量RT-PCR诊断方法与诊断试剂尤其重要。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测人杯状病毒的三重荧光定量RT-PCR试剂盒，由定量RT-PCR反应液管、酶混合液管、引物探针混合液管、阴性对照品管、三个标准品管、三个阳性对照品管和盒体组成。其中定量RT-PCR反应液管包含有PCR反应缓冲液、氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物，酶混合液管包含耐热Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶，引物探针混合液管包含三种病毒的特异性引物和相应的三种不同荧光标记的探针。阴性对照为高温高压灭菌的DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水，阳性对照为GI型诺如病毒、GII型诺如病毒、札如病毒的阳性质粒样品。引物探针混合液管需为棕色管。三重荧光定量RT-PCR检测用上游引物和下游引物以及相应的特异性探针序列如下 上游引物 NVG1-F: 5’ - ATGTTCCGBTGGATGCGSTT-3’下游引物 NVG1-R :5’ - TCCTTAGACGCCATCATCAITTAC-3’ 特异性探针 NVG1-P: 5’ -FAM-ACAGGRGATCGCRATCTYCTGCC-BHQ1-3’ 上游引物 NVGI1-F: 5，-GARCCNATGTTCAGRTGGATG-3， 下游引物 NVGI1-R: 5’ -CGACGCCATCTTCAITCACA-3’ 特异性探针 NVGI1-P: 5’- HEX-TCACRTGGGAGGGCGATCGCAA-BHQ1-3’上游引物 SV-F: 5 ’ - CAGGCTCTCGCCACCTACA-3， 下游引物 SV-R: 5- TGCCCTCCATCTCAAACACTAIT-3’ 特异性探针 SV-P: 5’-ROX- CTTGGITYATAGGTGGTACAGTRCC-BHQ2-3’ 上述标准品包括GI型诺如病毒、GII型诺如病毒和札如病毒标准品，其保守区基因序列如下 GI型诺如病毒病毒标准品序列为 ATGGCAAGCC ATGTTCCGTT GGATGCGGTT CCATGACCTT GGTTTGTGGA CAGGAGATCGCAATCTCCTG CCCGAATTTG TAAATGATGA TGGCGTCTAA GGACGCCCCT CAAAGCGCTG ATGGCGCAAGII型诺如病毒病毒标准品序列为 ACGTGCCAAG ACAAGAGCCA ATGTTCAGAT GGATGAGATT CTCGGATCTG AGCACGTGGGAGGGCGATCG CMTCTGGCT CCCAGTTTTG TGAATGAAGA TGGCGTCGAA TGACGCCACT CCATCTAA札如病毒标准品序列为 AACACCAACT ATGACCAGGC TCTCGCCACC TACAATGCTT GGTTCATAGG TGGTACAGTACCTGACCCAG TGGGTTACAC TGAAGGAACC CACAAAATAG TGTTTGAGAT GGAGGGCAATGGCTCCAACT CAGA。本专利技术提供的荧光定量试剂盒需保存于-20°c，尽量减少反复冻融；引物探针混合液需避光条件下保存。 本专利技术的另一个目的是提供上述的一步法三重荧光定量RT-PCR检测试剂盒在检测GI型诺如病毒、GII型诺如病毒和札如病毒中的应用。本专利技术试剂盒的使用方法在每次标本检测中均应设立阳性对照和阴性对照。标准品用高温高压灭菌的DEPC水稀释为IX IO3-1X 108copies/ml。粪便或肛拭子样本核酸的提取取0.2g或200 ml粪便样本加到EP管中，加入1.5ml的生理盐水，震荡混匀3次，每次10s，然后室温静置lOmin，以8000r/min离心5min。吸取200 ml上清加入到EP管中，进行核酸提取；肛拭子标本要在标本运输(保存)液中充分搅动(至少40下)，以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等，可以直接吸取200ul上清加到EP管中，进行核酸提取。核酸提取采用Geneaid公司的Viral Nucleic Acidextraction KitII 或 QIAGEN 公司的 QIAamp DNA Stool Mini Kit,按照试剂盒说明书进行提取，取5ul已抽提的待测样品核酸作为模板。核酸的检测取5ul已抽提的待测样品核酸作为模板。反应总体积为25 ml，其中定量RT-PCR反应液12. 5 ml，酶混合液I ml，引物探针混合液(20 y mol/L，包含三种病毒的特异性引物和相应的三种荧光探针)共4. 5ml，模板5ml，加水补足至25 ml。在ABI7500荧光定量PCR仪(或者其他三色荧光以上的P本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测人杯状病毒的三重荧光定量RT?PCR试剂盒,其特征在于，该试剂盒由定量RT?PCR反应液管(1)、酶混合液管(2)、引物探针混合液管(3)、阴性对照品管(4)、三个标准品管（5）、三个阳性对照品管（6）和盒体（7）组成，其中定量RT?PCR反应液管（1）包含有PCR反应缓冲液、氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物，酶混合物管（2）包含耐热Taq?DNA聚合酶、RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶；引物探针混合液管（3）包含GI型诺如病毒、GII型诺如病毒、札如病毒三种病毒的特异性引物和相应的三种荧光标记的探针；三个标准品管（5）分别放置GI型诺如病毒标准品、GII型诺如病毒标准品、札如病毒标准品；三个阳性对照品管（6）分别放置GI型诺如病毒阳性对照品、GII型诺如病毒阳性对照品、札如病毒阳性对照品；阴性对照管(4)包含高温高压灭菌的焦碳酸二乙酯处理水，三个阳性对照品分别为包含GI型诺如病毒、GII型诺如病毒和札如病毒的保守区基因序列的阳性质粒样品；检测用上游引物和下游引物以及相应的特异性探针序列如下：上游引物NVGI?F:?5’??ATGTTCCGBTGGATGCGSTT?3’下游引物NVGI?R：5’??TCCTTAGACGCCATCATCATTTAC?3’特异性探针NVGI?P:?5’?FAM?ACAGGRGATCGCRATCTYCTGCC?BHQ1?3’上游引物NVGII?F:?5’?GARCCNATGTTCAGRTGGATG?3’下游引物NVGII?R:?5’?CGACGCCATCTTCATTCACA?3’特异性探针NVGII?P:?5’??HEX?TCACRTGGGAGGGCGATCGCAA-?BHQ1?3’上游引物SV?F:?5’??CAGGCTCTCGCCACCTACA?3’下游引物SV?R:?5??TGCCCTCCATCTCAAACACTATT?3’特异性探针SV?P:?5’?ROX??CTTGGTTYATAGGTGGTACAGTRCC?BHQ2?3’所述的三种标准品基因序列如下：GI型诺如病毒病毒标准品序列为：ATGGCAAGCC?ATGTTCCGTT?GGATGCGGTT?CCATGACCTT?GGTTTGTGGA?CAGGAGATCG?CAATCTCCTG?CCCGAATTTG?TAAATGATGA?TGGCGTCTAA?GGACGCCCCT???CAAAGCGCTG???ATGGCGCAAGII型诺如病毒病毒标准品序列为：ACGTGCCAAG?ACAAGAGCCA?ATGTTCAGAT?GGATGAGATT?CTCGGATCTG?AGCACGTGGG?AGGGCGATCG?CAATCTGGCT?CCCAGTTTTG?TGAATGAAGA?TGGCGTCGAA???TGACGCCACT????CCATCTAA札如病毒标准品序列为：AACACCAACT?ATGACCAGGC?TCTCGCCACC?TACAATGCTT?GGTTCATAGG?TGGTACAGTA?CCTGACCCAG?TGGGTTACAC?TGAAGGAACC?CACAAAATAG?TGTTTGAGAT???GGAGGGCAAT???GGCTCCAACT???CAGA?。...
【技术特征摘要】
1.一种检测人杯状病毒的三重荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于，该试剂盒由定量RT-PCR反应液管(I)、酶混合液管(2)、引物探针混合液管(3)、阴性对照品管(4)、三个标准品管(5 )、三个阳性对照品管(6 )和盒体(7 )组成，其中定量RT-PCR反应液管(I)包含有PCR反应缓冲液、氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物，酶混合物管(2)包含耐热Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶；引物探针混合液管(3)包含GI型诺如病毒、GII型诺如病毒、札如病毒三种病毒的特异性引物和相应的三种荧光标记的探针；三个标准品管(5)分别放置GI型诺如病毒标准品、GII型诺如病毒标准品、札如病毒标准品；三个阳性对照品管(6)分别放置GI型诺如病毒阳性对照品、GII型诺如病毒阳性对照品、札如病毒阳性对照品；阴性对照管(4)包含高温高压灭菌的焦碳酸二乙酯处理水，三个阳性对照品分别为包含GI型诺如病毒、GII型诺如病毒和札如病毒的保守区基因序列的阳性质粒样品； 检测用上游引物和下游引物以及相应的特异性探针序列如下 上游引物 NVG1-F: 5’ - ATGTTCCGBTGGATGCGSTT-3’下游引物 NVG1-R :5’ - TCCTTAGACGCCATCATCATTTAC-3’ 特异性探针 NVG1-P: 5’ -FAM-ACAGGRGATCGCRATCTYCTGCC-BHQ1-3’ 上游引物 NVGI1-F: 5，-GARCCNATGTTCAGRTGGATG-3， 下游引物 NVGI1-R: 5’ -CGACGCCATCTTCATTCACA-3’ 特异性探针 NVGI1-P: 5’- HEX-TCACRTGGGAGGGCGATCGCAA-BHQ1-3’上游引物 SV-F: 5 ’ - CAGGCTCTCGCCACCTACA-3， 下游引物 SV-R: 5- TGCCCTCCATCTCAAACACTATT-3’ 特异性探针 SV-P: 5’-ROX- CTTGGTTYATAGGTGGTACAGTRCC-BHQ2-3’ 所述的二种...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈瑜，李兰娟，谢国良，崔大伟，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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