本发明专利技术属微流控芯片技术领域，具体为一种基于硅凝胶氧化石墨烯复合膜的蛋白酶解微流控芯片及其制备方法。石墨粉通过化学氧化和超声分散得氧化石墨烯水溶液，与正硅烷乙酯水解制得的硅溶胶混合后，注入表面经硅凝胶化处理的有机玻璃微流控芯片通道内，一定时间后移出修饰溶液并干燥得修饰有硅凝胶氧化石墨烯复合膜的微流控芯片。然后，在通道内注入1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的混合溶液，使通道表面氧化石墨烯上的羧基活化，接着注入胰蛋白酶等蛋白酶溶液，使蛋白酶通过共价键进行固定，得蛋白酶解微流控芯片。本发明专利技术制备的微流控芯片蛋白酶解反应器具有酶解时间短、样品用量少和价格低廉等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属微流控芯片
，具体涉及一种。
技术介绍
石墨烯(graphene)是由单层碳原子紧密堆积成二维蜂窝状晶格结构的一种碳质新材料，是构建其他碳素材料(如零维富勒烯、一维碳纳米管、三维石墨)的基本单元。自从2004年英国Manchester大学的Geim等人发现单层石墨烯以来石墨烯受到了全世界科学家的广泛关注。石墨烯具有优异的电学、热学和力学性能，可望在高性能纳电子器件、电 池、电化学电容、复合材料、场发射材料、气体传感器及能量存储等领域获得广泛应用[2]。由于其独特的二维结构和优异的晶体学质量，石墨烯蕴含了丰富而新奇的物理现象，具有重要的理论研究价值。过去几年中，石墨烯已经成为了备受瞩目的国际前沿和研究热点。目前，制备石墨烯的方法有机械剥离法、化学气相沉积法、石墨化学氧化剥离法等，其中第三种方法是目前制备氧化石墨烯和石墨烯最常用也是最经济的方法。将石墨用高锰酸钾等强氧化剂氧化，然后通过超声剥离得氧化石墨烯，其基本结构是表面带有羧基、羟基、羰基和环氧基的碳的单原子层，其含有丰富的含氧官能团[3]，在水中分散良好，容易与其它水溶性材料复合。由于氧化石墨烯含丰富的官能团，可通过化学修饰的方法制备石墨烯衍生物，甚至可与酶和蛋白等生物大分子共价键结合，在构建微流控芯片生化微反应器方面具有得天独厚的优势，目前，尚未见有关报道。自从瑞士 Ciba-Geigy公司的Manz和Widmer [4]首次提出微型全分析系统(M~TAS)以来，微流控芯片就以其高效、快速、试剂用量少、低耗以及集成度高等优点引起了国内有关专家的广泛关注，在其方法学研究迅速发展的基础上，微流控芯片在生物医学研究、临床诊断、药物分析、环境监测、法医和军事等领域显示了良好的应用前景&7]。微流控芯片以微机电加工技术为依托，以微管道网络为结构特征，以生命科学为目前主要应用对象，是当前微全分析系统领域发展的重点。微流控芯片是把生物、化学、医学分析过程的采样、稀释、加试剂、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块几个平方厘米大的芯片上，自动完成分析全过程。由于它在生物、化学、医学等领域的巨大应用潜力，已经发展成为一个生物、化学、医学、流体、电子、材料、机械等多学科交叉的崭新研究领域。微流控芯片微流通道尺寸在微米级，是纳升到微升级小体积样品的理想操作和分析平台，特别适用于生物医药分析和临床检测小体积样品的酶法和免疫法分析和检测。其中一个很重要的用途是用于蛋白质的酶解和分析。蛋白质酶解是蛋白组学中蛋白质分析的一个关键步骤，待测样品中的蛋白通过电泳分离后用蛋白水解酶水解成肽，然后用质谱测定其分子量得肽质量图谱，经检索有关数据库后完成蛋白鉴定。传统的溶液酶解灵敏度低且耗时(12小时以上)，加上蛋白水解酶自身酶解产生的肽也会干扰目标蛋白的鉴定，所以溶液酶解时蛋白和酶的比例通常要求在20-40:1，以降低游离蛋白酶自身酶解的干扰，但由于蛋白酶浓度低，酶解效率不高，所以建立高效快速的新型蛋白质酶解方法具有重要意义。解决上述问题的主要途径就是使用固定化酶技术，通常使用的微流控芯片酶反应器是将蛋白酶如胰蛋白酶通过溶胶-凝胶包埋[8’9]技术固定在微流控芯片通道内表面。存在的问题是由于酶不是通过共价键固定，容易流失，影响酶解效果。参考文献[1]Novoselov KS, Geim AK, Morozov SV, et al. Science 2004, 306, 666-669.[2]Martin P. Chem. Re. , 2009, 9, 211—223.[3]Compton 0C, Nguyen ST. Small 2010， 6， 711-723. [4]Manz A, Graber N, Widmer HM. Sens. Actuators B 1990, I, 244-248.[5]Dittrich, PS, Tachikawa K, Manz A. Anal. Chem. 2006, 78, 3887-3908.[6]Auroux PA, Iossifidis D, Reyes DR, and Manz A. Anal. Chem. 2002, 74,2637-2652.[7]Verpoorte E. Electrophoesis 2002, 23, 677-712.[8]Qu HY, Wang H.，Huang Y, et al. Anal. Chem. 2004，76，6426-6433.[9]Wu HL, Tian YP, Liu BH, et al. J. Proteome Res. 2004, 3, 1201-1209.
技术实现思路
本专利技术的目的在于提出一种能够大幅降低酶解时间并提高蛋白酶解效率的。本专利技术提出的基于硅凝胶氧化石墨烯复合膜的蛋白酶解微流控芯片的制备方法，具体步骤为 (1)通过光刻和化学湿法刻蚀的方法，加工出用于复制带有分离通道的微流控芯片基片的娃阳模； (2)将少量热引发剂偶氮二异丁腈和少量光引发剂安息香溶解在甲基丙烯酸甲酯中，于80-90°C水浴中加热15-20分钟，使其预聚成甘油状清亮铸模溶液，将此含光引发剂的铸模溶液沿微流控芯片硅阳模凸出的分离通道浇在硅阳模上并成条状，将一片有机玻璃片盖在预聚的铸模溶液上并压紧，然后用紫外光通过有机玻璃片照射预聚的铸模溶液，引发本体聚合，制作得含有微流通道的微流控芯片基片；将硅阳模用玻璃板代替，制作得微流控芯片盖片；将所述基片和所述盖片发生原位聚合的一面通过热压键合，制作得有机玻璃微流控芯片成品； (3)将石墨粉分散在浓硫酸中并用冰浴冷却，然后加入硝酸钾和高锰酸钾进行氧化，再加入双氧水后用稀盐酸洗涤得氧化石墨，然后将氧化石墨分散到水溶液中，用超声波进行剥离，得氧化石墨烯水溶液；将正硅烷乙酯与乙醇和稀盐酸混合水解，得硅溶胶；将硅溶胶与氧化石墨烯水溶液混合，得微流控芯片通道修饰溶液； (4)将正硅酸乙酯注入有机玻璃微流控芯片微通道，2-4小时后正硅酸乙酯充分渗入微通道的表层；用水冲去通道内多余的正硅酸乙酯，注入稀盐酸水解1-3小时，得通道表面经硅凝胶化处理的有机玻璃微流控芯片，然后将硅溶胶和石墨烯水溶液混合制得的修饰溶液注入表面经硅凝胶化处理的有机玻璃微流控芯片通道内，然后移出修饰溶液，并干燥，得修饰有硅凝胶氧化石墨烯复合膜的微流控芯片；(5)在通道内注入1-(3- 二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的混合溶液，使通道表面氧化石墨烯的羧基活化，接着注入胰蛋白酶等蛋白酶溶液，使蛋白酶通过共价键进行固定，得蛋白酶解微流控芯片。本专利技术的步骤(2)中，所述有机玻璃微流控芯片通道的深度为20-50微米，底部宽度20-60微米，上部宽度50-200微米。本专利技术的步骤(2)中，有机玻璃盖片对应于微流控芯片基片上通道的末端的位置钻有直径为1-3毫米的圆形小孔，用于进样和收集蛋白酶解产物。本专利技术的步骤(2)中，所述热压键合的热压温度为105-110°C，施加在两片玻璃板上的微流控芯片上的热压压力为0. 5-5公斤/平方厘米，热压时间为10-20分钟。本专利技术的步骤(3)中，所述氧化石墨烯水溶液的浓度为1-10毫克/毫升，硅溶胶溶液的浓度为10-100毫克/毫本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于硅凝胶氧化石墨烯复合膜的蛋白酶解微流控芯片的制备方法，其特征在于具体步骤为：（1）通过光刻和化学湿法刻蚀的方法，加工出用于复制带有分离通道的微流控芯片基片的硅阳模；（2）将热引发剂偶氮二异丁腈和光引发剂安息香溶解在甲基丙烯酸甲酯中，于80?90℃水浴中加热15?20分钟，使其预聚成甘油状清亮铸模溶液；将此含光引发剂的铸模溶液沿微流控芯片硅阳模凸出的分离通道浇在硅阳模上并成条状，将一片有机玻璃片盖在预聚的铸模溶液上并压紧，然后用紫外光通过有机玻璃片照射预聚的铸模溶液，引发本体聚合，制作得含有微流通道的微流控芯片基片；将硅阳模用玻璃板代替，制作得微流控芯片盖片；将所述基片和所述盖片发生原位聚合的一面通过热压键合，制作得有机玻璃微流控芯片成品；??（3）将石墨粉分散在浓硫酸中并用冰浴冷却，然后加入硝酸钾和高锰酸钾进行氧化，再加入双氧水后用稀盐酸洗涤得氧化石墨，然后将氧化石墨分散到水溶液中，用超声波进行剥离，得氧化石墨烯水溶液；将正硅烷乙酯与乙醇和稀盐酸混合水解，得硅溶胶；将硅溶胶与氧化石墨烯水溶液混合，得微流控芯片通道修饰溶液；（4）将正硅酸乙酯注入有机玻璃微流控芯片微通道，2?4小时后正硅酸乙酯充分渗入微通道的表层；用水冲去通道内多余的正硅酸乙酯，注入稀盐酸水解1?3小时，得通道表面经硅凝胶化处理的有机玻璃微流控芯片，然后将硅溶胶和石墨烯水溶液混合制得的修饰溶液注入表面经硅凝胶化处理的有机玻璃微流控芯片通道内，然后移出修饰溶液，并干燥，得修饰有硅凝胶氧化石墨烯复合膜的微流控芯片；（5）在通道内注入1?(3?二甲基氨丙基)?3?乙基碳二亚胺盐酸盐和N?羟基丁二酰亚胺的混合溶液，使通道表面氧化石墨烯的羧基活化，接着注入胰蛋白酶等蛋白酶溶液，使蛋白酶通过共价键进行固定，得蛋白酶解微流控芯片；步骤（2）中，所述有机玻璃微流控芯片通道的深度为20?50微米，底部宽度20?60微米，上部宽度50?200微米。...
【技术特征摘要】
1.一种基于硅凝胶氧化石墨烯复合膜的蛋白酶解微流控芯片的制备方法，其特征在于具体步骤为 (1)通过光刻和化学湿法刻蚀的方法，加工出用于复制带有分离通道的微流控芯片基片的娃阳模； (2)将热引发剂偶氮二异丁腈和光引发剂安息香溶解在甲基丙烯酸甲酯中，于80-90°C水浴中加热15-20分钟，使其预聚成甘油状清亮铸模溶液；将此含光引发剂的铸模溶液沿微流控芯片硅阳模凸出的分离通道浇在硅阳模上并成条状，将一片有机玻璃片盖在预聚的铸模溶液上并压紧，然后用紫外光通过有机玻璃片照射预聚的铸模溶液，引发本体聚合，制作得含有微流通道的微流控芯片基片；将硅阳模用玻璃板代替，制作得微流控芯片盖片；将所述基片和所述盖片发生原位聚合的一面通过热压键合，制作得有机玻璃微流控芯片成品; (3)将石墨粉分散在浓硫酸中并用冰浴冷却，然后加入硝酸钾和高锰酸钾进行氧化，再加入双氧水后用稀盐酸洗涤得氧化石墨，然后将氧化石墨分散到水溶液中，用超声波进行剥离，得氧化石墨烯水溶液；将正硅烷乙酯与乙醇和稀盐酸混合水解，得硅溶胶；将硅溶胶与氧化石墨烯水溶液混合，得微流控芯片通道修饰溶液； (4)将正硅酸乙酯注入有机玻璃微流控芯片微通道，2-4小时后正硅酸乙酯充分渗入微通道的表层；用水冲去通道内多余的正硅酸乙酯，注入稀盐酸水解1-3小时，得通道表面经硅凝胶化处理的有机玻璃微流控芯片，然后将硅溶胶和石墨烯水溶液混合制得的修饰溶液注入表面经硅凝胶化处理的有机玻璃微流控芯片通道内，然后移出修饰溶液，并干燥，得修饰有硅凝胶氧化石墨烯复合膜的微流控芯片； (5)在通道内注入1-(3-二甲...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈刚，魏邦国，包慧敏，张鲁雁，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：
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