本发明专利技术涉及家蝇对拟除虫菊酯类杀虫剂靶标抗性的分子检测方法。采用根据家蝇钠离子通道基因的敏感与抗性基因型设计的特异性引物，以单头家蝇的基因组DNA为模板，进行钠离子通道基因片段的PCR扩增，根据对PCR产物的电泳检测，来区分家蝇个体的基因型，检测抗性基因型频率。本发明专利技术涵盖家蝇钠离子通道的1014F，1014H，918T三种抗性点突变的检测方法。该方法经济、快速、高通量、准确性高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及家蝇对拟除虫菊酯类靶标抗性的分子检测技术，属于生物
，适合用于家蝇对拟除虫菊酯类杀虫剂抗性的快速检测。
技术介绍
家蝇(Musca domestica)是一种重要的疾病传媒,据报道它可以传播100多种人畜疾病。家蝇也是重要的畜牧业害虫，家蝇的发生可以导致畜禽产品产量和质量的降低。因此家蝇种群的控制对于人类的健康和国民经济的发展都具有十分重要的意义。家蝇的防治长期以来主要依赖化学农药，抗药性问题突出。抗药性导致杀虫剂杀虫效率的下降，由此引发诸如杀虫剂使用次数和剂量增加，虫媒人畜疾病的流行等问题已给人类带来巨大损失。拟除虫菊酯杀虫剂(如溴氰菊酯)已广泛用于家蝇的防治，家蝇对这类杀虫剂普 遍产生了抗性。抗药性的检测是科学制定有效的防治措施的前提，对减少化学药剂对环境的污染和合理制定抗药性治理具有重要的指导意义。家蝇对拟除虫菊酯类的抗性的检测常采用生物测定，这种方法存在如下缺点(I)试验周期长一般需要24小时以上才能得到生测结果；(2)对试虫的数量和质量要求高为保证生测结果的准确性，需要使用特定生理状态的试虫；(3)难于检测早期抗性和预测抗性的发展趋势生物测定的方法只能记录杀虫剂剂量和试虫死亡率的信息，而无法测定个体的基因型。近年来，随着对家蝇抗药性抗性分子机制的了解，国内外开始尝试家蝇抗性的分子检测技术的研究。经过多年的研究发现，家蝇对拟除虫菊酯类抗性的主要机制之一是钠离子通道基因的点突变导致家蝇对农药的敏感性下降(即靶标不敏感性)。靶标不敏感主要是钠离子通道蛋白在1014位点的氨基酸变异(亮氨酸L变为苯丙氨酸F或组氨酸H，称为击倒抗性)以及918位点上的蛋氨酸(M)替换为苏氨酸(T)。918位点的抗性突变只见于存在1014F抗性突变的个体，这两抗性位点的突变组合称为超击倒抗性。至今，在国内外只建立了基于PCR的L1014F抗性突变的检测方法，而我们的研究发现，在我国，L1014H变异的频率更高，而且在高抗性家蝇品系中还存在M918T这一抗性相关的遗传变异。(Qiu X，Li M, Luo H, Fu T. 2007 Molecular analysis of resistancein a deltamethrin—resistant str ain of Musca domestica from China. PesticideBiochemistry and Physiolog y 89(2) :146-150)
技术实现思路
本专利技术是根据我们对我国各地家蝇抗药性机制的了解，提出了家蝇抗药性的分子检测方法，包括L1014F，L1014H, M918T三个抗性突变的检测方法。因此，本专利技术的目的是根据对我国各地家蝇抗药性机制的了解，建立可用于检测家蝇对拟除虫菊酯类靶标抗性的分子检测方法。本专利技术的一方面涉及一种，该方法包含下列步骤(I)提取单头家蝇基因组DNA ；(2)对家蝇钠离子通道基因1014位点抗性相关变异进行分子检测；(3)对家蝇钠离子通道基因918位点抗性相关变异进行分子检测。其中，所述家蝇钠离子通道基因序列选自SEQ ID NO :10(钠离子通道基因1014L)、11(钠离子通道基因1014F)、12(钠离子通道基因1014H)、13 (钠离子通道基因918M)、14(GenBank登录号为EF592581，钠离子通道基因918T)所示。其中，1014的位点抗性相关变异为L1014F或L1014H，918位点抗性相关变异为M918T，可以使用PCR方法对家蝇钠离子通道基因编码的1014氨基酸位点和918氨基酸位点抗性相关的变异进行分子检测。在一个特定的实施方案中，对家蝇钠离子通道基因1014位点抗性相关变异的PCR检测使用下列5种PCR引物 PF :正向通用外引物，序列为 5’ -CAT GAT TGT GTT CCG AGT GC-3，(SEQ ID NO:1);PR:反向通用外引物，序列为 5’ -CGA AGT TGG ACA AAA GCA AA-3’ (SEQ ID NO:2)PL : 1014L 敏感基因特异性引物，序列为 5 ’ -TGG CCA CGT CAA CTTACC ACGAG-3’ (SEQ ID NO 3)PF 1014F抗性基因型特异性引物，序列为5’ -CCA CGG TCG TGA TCG GCAGTT-3’ (SEQ ID NO 4)PH :1014H抗性基因型特异性引物，序列为5’ -CAC GGT CGT GA TCGG CAA TCAT-3，(SEQ ID NO 5)其中，对每个个体设置3个PCR反应，分别使用三种不同的引物混合物，即Al (PF+PR+PL, 1:1:3 混合)，A2 (PF+PR+PF, 1:1:3 混合)，A3 (PF+PR+PH, 1:1:3混合)。PCR 反应程序为94°C 3min ；94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s，35 个循环；72°C IOmin0在另一个特定的实施方案中，对家蝇钠离子通道基因918位点抗性相关变异的PCR检测使用下列4种PCR引物SI :5，-TCA ACA CCA ACA CCA TTA CAT AT-3，(SEQ ID NO 6)S2 :5，-CGT GAT GGG AAT GCA ACT TTT CGG A_3，(SEQ ID NO 7)S3 :5’ -CAC TGA ATT TAC TCA TTT CGA TGA T-3’ (SEQ ID NO 8)S4 :5，-CCC ATT GTC CGG CCC G_3’ (SEQ ID NO :9)其中，PCR 反应中引物 S1、S2、S3和 S4 的混合比例为 I : I : 3 : 3。PCR 反应程序为94°C 3min ；94V 30s, 50°C 30s,72°C 30s，30 个循环；72V IOmin0本专利技术的另一方面涉及上述方法在家蝇抗药性检测中的应用。本专利技术的第三方面涉及一种用于家蝇对拟除虫菊酯类杀虫剂靶标抗性检测的试剂盒，包括(I)用于提取单头家蝇基因组DNA的试剂；(2)用于对家蝇钠离子通道基因1014位点抗性相关变异进行分子检测的试剂；(3)用于对家蝇钠离子通道基因918位点抗性相关变异进行分子检测的试剂。在一个特定的实施方案中，用于对家蝇钠离子通道基因1014位点抗性相关变异进行分子检测的试剂包括下列5种PCR引物PF :正向通用外引物，序列为 5’ -CAT GAT TGT GTT CCG AGT GC-3，(SEQ ID NO:1);PR:反向通用外引物，序列为 5’ -CGA AGT TGG ACA AAA GCA AA-3’ (SEQ ID NO:2)PL : 1014L 敏感基因特异性引物，序列为 5 ’ -TGG CCA CGT CAA CTTACC ACGAG-3’ (SEQ ID NO 3)PF 1014F抗性基因型特异性引物，序列为5’ -CCA CGG TCG TGA TCG GCAGTT-3’ (SEQ ID NO 4)PH :1014H抗性基因型特异性引物，序列为5’ -CAC GGT CGT GA TCGG CAA TCA T-3，(SEQ ID NO本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种家蝇对拟除虫菊酯类杀虫剂靶标抗性的分子检测方法，包含下列步骤：(1)提取单头家蝇基因组DNA；(2)对家蝇钠离子通道基因1014位点抗性相关变异进行分子检测；(3)对家蝇钠离子通道基因918位点抗性相关变异进行分子检测。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邱星辉，李梅，王庆敏，周云辉，
申请(专利权)人：中国科学院动物研究所，
类型：发明
国别省市：
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