本发明专利技术的方面包括涉及能够进行软骨发生的胚胎祖细胞系的产生、识别和使用的方法和组合物。公开了来源于原始干细胞的许多示例性软骨形成细胞系。本文中公开的软骨形成细胞系是强健的，可扩增超过40代，并且具有位点特异性纯度，从而提供了用于产生用于研究和治疗的具有独特分子组成的不同软骨类型的组合物和方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于体外和体内软骨发生的方法和组合物交叉引用本申请根据35U.S.C. § 119(e)要求下列临时专利申请的优先权2009年7月16日提交的标题为 “Methods and Compositions Useful for In Vitro and In VivoChondrogenesis Using Embryonic Progenitor Cell Lines，，的第 61/226，237 号申请；2009年9月 18 日提交的标题为“Improved Methods of Screening Embryonic ProgenitorCell Lines”的第 61/243，939 号申请；2010 年 5 月 27 日提交的标题为“Improved Methodsof Screening Embryonic Progenitor Cell Lines” 的第 61/349,088 申请；和 2010年 7 月 16 日提交的标题为 “Methods and Compositions for In Vitro and In VivoChondrogenesis”的第61/365，308号申请。这些申请的每一个的全部内容通过引用并入本文。
技术介绍
软骨的有限再生能力限制了身体的修复因创伤或退行性疾病引起的损伤的天然能力。例如，骨关节炎(OA)折磨高达70%的65岁以上的个体(2100万美国人)。对半月板或前交叉韧带的损伤通常让患者处于增加患关节炎的风险中。骨关节炎的特征在于关节表面上软骨的逐渐丢失，从而导致疼痛的软骨下骨暴露。在对关节软骨的该损伤后，人组织几乎不显示修复能力。作为固有修复反应的结果出现的新生软骨本质上通常是纤维状的，从而不适合用于修复。已开发了多种治疗方案用于治疗患有软骨损伤的受试者。此类治疗的实例包括意欲使用机械手段(例如，摩擦和微小骨折手术例如钻孔、微小骨折手术、软骨成形术和海绵化(spongialization);激光辅助治疗,其将患病软骨的去除与软骨矫形结合)触发受试者的软骨产生的治疗和依赖于组织至损伤部位的移植(或嫁接(grafting))(例如，骨膜移植、骨软骨移植(软骨镶嵌术)和关节软骨糊移植(articular cartilage pastegrafting))的治疗。此类治疗的成功率可变化并且某些治疗具有潜在的有害副作用，包括组织坏死、反应性滑膜炎(reactive synovitis)、软骨溶解和关节软骨退变的加速。称为自体软骨细胞治疗(ACT)的基于细胞的软骨治疗方案包括从软骨取出软骨细胞、体外扩增细胞和利用或不利用支持基质(或其它蛋白质或蛋白聚糖)将这些扩增的细胞施用至患者内。ACT治疗因人关节软骨细胞的去分化(当在体外培养时)以及再分化细胞(以便它们在移植位置产生丰富的软骨基质)的相对困难而变得复杂。此外，只有少量软骨可从人收集，从而只有少量软骨细胞可被用于起始培养。因此，实践中在将分离的人软骨细胞应用于移植治疗中一直存在困难。另一个治疗策略是利用源自骨髓的间充质干细胞(hbmMSC)。利用单次剂量的hbmMSC(软骨素原(Chondrogen))的临床研究显示与透明质酸(HA)对照相比的疼痛的减轻。然而，间充质干细胞(MSC)在它们用于再生软骨的方面具有两个障碍。第一，因成体MSC的有限的增殖能力的原因导致细胞作为同种异体移植物的用途是有问题的，即使细胞能够进行一定量的扩增，它们通常也相对快速地失去它们形成软骨的能力。第二个障碍是MSC例如源自骨髓的MSC形成肥大软骨细胞，其特征在于高水平的C0L10A1和IHH表达。这些软骨细胞在发育中的作用是补充血管和成骨细胞，然后死亡。在例如长骨的生长面区域观察到肥大软骨细胞。也在骨折位置观察到它们，在所述位置中它们类似地在骨形成中起着重要作用。因此，在软骨的创伤和退变疾病例如骨关节炎的治疗中使用MSC已产生混合结果。此外，在体内存在许多软骨类型。耳的弹性软骨具有与鼻、胸骨、气管和承重关节的分子组成不同的分子组成。因此，再生医学领域，特别是在软骨再生和修复领域内，急需要产生商业量的多种类型的永久性软骨细胞(与肥大软骨细胞相反)的新型细胞制剂。概要本专利技术的方面包括与能够进行软骨发生的胚胎祖细胞系的产生、识别和使用相关的方法和组合物。公开了许多示例性源自原始干细胞的软骨形成细胞系。本文中描述的软骨形成细胞系是强健的，可扩增超过40代，并且具有位点特异性纯度(site-specificpurity)，从而提供了产生用于研究和治疗的具有独特分子组成的多种软骨类型的组合物和方法。附图说明图I :在软骨形成微团条件下的14天之前和之后通过qPCR测定的细胞系中C0L2A1的诱导的水平。图2 :显示处于未分化和分化条件下的MSC对照连同本专利技术的细胞系中的软骨相关基因 C0L2A1、CRTAC1、CD74、(2A) LECT1、IHH 和 LHX8 (2B)的相对表达。图3 :显示脂肪组织干细胞与第14代的细胞系4D20. 8相比较，与第6代的MSC相比较的番红O染色(全部细胞系都处于以沉淀形式进行的分化的第21天)和第14天的细胞系4D20. 8和MSC的沉淀的免疫染色(以同种型为对照)的实例。图4 :显示4D20. 8RGD-藻酸盐(图4A)、E15RGD-藻酸盐和SM30RGD-藻酸盐(图4B)的体内植入的结果。图5 :显示示例性组织学图像，该图像显示4D20.8和E15的与透明软骨中的软骨细胞的外观相似的软骨细胞样外观。缩写AFP -甲胎蛋白BMP -骨形态发生蛋白BRL -水牛大鼠肝BSA -牛血清白蛋白CD -集群名称(Cluster Designation)cGMP -现行良好操作规范(Current Good Manufacturing Processes)CNS -中枢神经系统DMEM -达尔伯克改良伊格尔培养基DMSO -二甲基亚砜DPBS -达尔伯克憐酸盐缓冲盐水(Dulbecco，s Phosphate Buffered Saline)EC -胚胎性癌EC细胞-胚胎性癌细胞；hEC细胞是人胚胎性癌细胞ECM -细胞外基质ED细胞-源自胚胎的细胞(Embryo-derived cell) ;hED细胞是人ED细胞EDTA -乙二胺四乙酸EG细胞-胚胎生殖细胞；hEG细胞是人EG细胞EP细胞-胚胎祖细胞是来源于原始干细胞的细胞，其比原始干细胞更加分化，因为它们在人物种的情况下不再展现标志例如SSEA4、TRAl-60或TRA-1-81血清阳性，但仍未完全分化。胚胎祖细胞对应于胚胎期，与发育的出生后期相反。ES细胞-胚胎干细胞；hES细胞是人ES细胞FACS -荧光激活细胞分选术FBS -胎牛血清GMP -药品生产和质量管理hED细胞-人胚胎来源的细胞hEG细胞-人胚胎生殖细胞是源自胎儿组织的原始生殖细胞的干细胞。hEP细胞-人胚胎祖细胞是来自人物种的胚胎祖细胞hiPS细胞-人诱导多能干细胞是具有与在暴露于hES-特异性转录因子例如S0X2、KLF4、0CT4、MYC或NANOG、LIN28、0CT4和S0X2后获自体细胞的hES细胞相似的性质的细胞。HSE -人皮肤等同物是细胞与被制造用于测试目的本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.07.16 US 61/226,237;2009.09.18 US 61/243,939;1.一种在受试者中产生软骨的方法，所述方法包括 给所述受试者施用有效量的胚胎祖细胞系组合物，其包括 (a)对于选自由⑶74、⑶90、⑶166、ITGA2、KCNK2及其组合组成的组中的一个或多个基因的表达呈阴性的胚胎祖细胞系；和 (b)药学上可接受的载体。2.权利要求I所述的方法，其中所述胚胎祖细胞系对于CD74的表达呈阴性。3.权利要求2所述的方法，其中所述胚胎祖细胞系还对于选自由HOX基因和PITXl组成的组中的一个或多个基因的表达呈阴性。4.权利要求I所述的方法，其中所述胚胎祖细胞系在不表达C0L10A1标志的情况下产生软骨。5.权利要求I所述的方法，其中所述胚胎祖细胞系选自由SM30、E15、4D20.8、7SM0032、MEL2、SK1U7PEND24和7SM007及其组合组成的组。6.权利要求I所述的方法，其中所述受试者具有软骨损伤并且所述方法包括给所述软骨损伤的位置施用所述胚胎祖细胞系组合物。7.权利要求6所述的方法，其中所述软骨损伤是关节软骨损伤。8.权利要求I所述的方法，其中所述药学上可接受的载体包括选自由羟乙基淀粉；透明质酸及其聚合物；硫酸软骨素；1型胶原；11型胶原；ΙΠ型胶原、聚酸酐、聚原酸酯、聚乙醇酸及其共聚物；藻酸盐；琼脂糖；泊洛沙姆；纤维蛋白；壳多糖和壳聚糖及其组合组成的组的组合物。9.权利要求I所述的方法，其中在给所述受试者施用之前在软骨细胞诱导条件下培养所述胚胎祖细胞系。10.权利要求I所述的方法，还包括随时间测量受损的软骨的修复速率。11.一种产生软骨的方法，所述方法包括在软骨产生性条件下，培养对于选自由CD74、⑶90、⑶166、ITGA2和KCNK2组成的组中的一个或多个基因的表达呈阴性的克隆性纯化的胚胎祖细胞系。12.权利要求11所述的方法，其中所述胚胎祖细胞系对于CD74的表达呈阴性。13.权利要求12所述的方法，其中所述胚胎祖细胞系还对选自由HOX基因和PITXl组成的组中的一个或多个基因的表达呈阴性。14.权利要求13所述的方法，其中所述胚胎祖细胞系在不表达C0L10A1标志的情况下产生软骨。15.权利要求11所述的方法，其中所述胚胎祖细胞系选自由SM30、E15、4D20.8、7S...
【专利技术属性】
技术研发人员：迈克尔·D··韦斯特，哈尔·斯滕伯格，克伦·B··查普曼，
申请(专利权)人：生物时代股份有限公司，
类型：
国别省市：
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