应用生物信息学快速鉴定番木瓜抗白粉病基因制造技术

本发明专利技术是快速鉴定番木瓜抗白粉病基因；涉及到植物比较基因组学，遗传学和生物信息学等学科知识，属于植物生物技术科学领域。该发明专利技术主要步骤为：1）番木瓜全基因组序列的下载及MLO型基因的采集；2）MLO型基因的鉴定；3）MLO型基因系统发育关系；4）MLO型白粉病基因的比对。该发明专利技术有效的缩短了番木瓜白粉病基因挖掘周期，有利于白粉病基因的快速鉴定；通过鉴定的候选白粉病基因开发相应的共分离功能性标记（SNP、SCAR等），还可以快速的用于抗白粉病基因的分子标记辅助选择，准确性高；结合其它抗病基因分子标记可进行多抗性育种材料的创制，缩短育种年限，提高育种效率；为阐述番木瓜抗白粉病分子机制奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是借助于番木瓜测序全基因组序列，利用植物比较基因组学、遗传学、生物信息学和候选基因策略等方法快速鉴定番木瓜白粉病基因，主要涉及到番木瓜全基因组序列的下载，候选基因的鉴定，基因的比对，聚类等手段，进而鉴定出白粉病基因，属于植物生物技术科学领域。
技术介绍
番木瓜(Ckrica papaya L.)又称万寿果、乳瓜，为番木瓜科，草本双子叶植物，是热带、亚热带地区的首选果树。随着人们对番木瓜营养、保健价值认识的不断加深，其市场需求量越来越大。近年来，白粉病在番木瓜种植区，如云南、贵州等地出现严重危害，导致提前落叶，结果量大减，果实含糖量低、口味差，商品价值降低。如何合理而有效地防治病害，已成为生产上的主要问题。生产上主要采用喷洒杀菌剂和种植抗病品种 的方法防御此病。但长期使用杀菌剂会危害环境安全，且易引起病菌小种变异产生拮抗作用。推广种植抗病品种是安全、环保和高效的控制策略。常规育种实践中，对于抗白粉病材料的选择是十分困难的一方面选育周期长，需要经历杂交和回交复杂的选择程序；另ー方面白粉病的发生受到很多因素的综合影响，例如温度、湿度和病菌小种等，鉴定抗性材料的过程不容易控制。因此，挖掘白粉病基因将可以加快番木瓜选育抗性品种的进程。MLO型抗病基因是植物特异的一类抗病基因。研究者最早发现MLOresistance locus 2)基因对白粉病抗性是始于1937-1938年，由德国人在埃塞俄比亚采集了很多品种的大麦，其中的两个株系对白粉病菌QUunwriei greiminis f. sp. hordei)所有己知的生理小种都具有高效抗性。进ー步研究表明，大麦中MLO基因的隐性突变mlo可以使大麦对几乎所有己知大麦白粉病菌的生理小种产生持久、广谱的抗性。最近，研究者发现很多植物的抗白粉病基因都是MLO型基因控制，如番茄，豌豆、拟南芥、薔薇、辣椒、百脉根等等。因此挖掘植物中的MLO型抗病基因对植物抗白粉病育种具有重要的作用。目前，常用挖掘抗病基因常用的方法有图位克隆，转座子标签等方法。但是由于番木瓜的基础研究不够深入，因此利用这些方法不仅时间长而且很难准确地克隆这些基因。因此，如何快速鉴定番木瓜中的MLO型抗病基因将成为番木瓜抗白粉病育种的重要前提。植物比较基因组学(Comparative Genomics)是基于基因组图谱和测序基础上,对已知的基因和基因组结构进行比较，来了解基因的功能、表达机理和物种进化的学科。利用模式植物基因组与其它植物基因组之间编码顺序上和结构上的同源性，克隆其他植物基因，掲示基因功能和分子机制，阐明物种进化关系及基因组的内在结构。本专利所采用的方法及思路模式植物拟南芥基因组研究已经掲示了 MLO型基因的功能，利用基因其顺序上的同源性克隆番木瓜MLO型抗病基因，根据模式植物拟南芥实验系统上的优越性和已知MLO型抗病基因的特点，快速“捕捉”番木瓜抗白粉病基因。近年来，番木瓜基因组测序的完成为我们快速挖掘番木瓜白粉病基因提供了条件。本专利介绍了以番木瓜全基因组序列为前提，结合比较基因组学、遗传学、基因组学、生物信息学和候选基因策略等知识，快速挖掘白粉病基因。
技术实现思路
技术问题 本专利技术的目的是提供一种通过结合植物比较基因组学、植物遗传学、基因组学和生物信息学等知识，快速挖掘番木瓜抗白粉病基因。其结果一方面可用于番木瓜白粉病基因紧密连锁分子标记的开发，进行分子标记辅助选择育种，另 一方面也为其他作物白粉病基因鉴定提供參考依据。技术方案 主要原理第一个植物抗白粉病基因(MLO)是从大麦中克隆的，研究发现此基因是ー类特殊的抗病基因，不同于先前克隆的大多数NBS (nucleotide-binding site)类型抗病基因；随后，研究者相继从番茄、拟南芥、豌豆、辣椒、百脉根等植物中克隆了白粉病基因，研究发现这些基因编码的都是MLO型抗病基因。随后，众多研究者通过多次试验证实MLO型抗病基因已经成为植物特有的ー类抗白粉病基因。进ー步发现，植物MLO类型基因是ー个基因家族；而且对来源于不同物种的MLO基因家族进行系统发育关系分析发现，不同物种中抗白粉病基因总是聚类一起，成为ー类，这ー类MLO基因都具有抗白粉病基因序列的典型特征。番木瓜基因组测序的完成为挖掘白粉病基因提供了一条便利途径。因此，可以借助于已经测序的番木瓜全基因组中MLO基因家族和已经克隆的MLO白粉病基因的系统发育关系以及对于维持白粉病基因MLO重要功能的氨基酸保守性来鉴定番木瓜白粉病基因。主要步骤如下 O番木瓜全基因组序列的下载及其MLO型基因的采集 首先从番木瓜测序基因组数据库(http://www. phytozome. net/search, php)下载番木瓜全基因组序列；使用“DNAT00LS”软件对获得的番木瓜全基因组氨基酸序列数据建立数据库，然后用pfam数据库(蛋白家族数据库，http://pfam.janelia.org/search/sequence)中的隐马尔可夫模型(HMM)对MLO结构域的氨基酸序列与已建立的番木瓜全基因组氨基酸序列数据库进行Blastp (E-value=0. 001)序列比对，初步筛选出候选基因序列。其次，利用已经公布的MLO型基因序列，对番木瓜基因组数据库进行BLAST比对，获得候选基因序列。2)番木瓜MLO型基因家族的鉴定 将上述结果中得到的同源核苷酸序列的候选基因，通过Pfam(E-Value=LO)进行分析，去除无‘ML0’结构域的基因序列(图I)。再将候选抗病基因序列通过MEGA3. I软件提供的ClustalW工具(多序列比对程序)进行多序列比对，去除重复序列。3)通过植物MLO型基因的系统发育关系鉴定候选的番木瓜MLO型白粉病基因 由于先前的研究已经证明，双子叶植物MLO型白粉病基因位于植物MLO基因系统发育树同一区组，因此在系统发育关系研究中，我们把拟南芥的MLO型基因家族和一些其他作物的MLO型抗白粉病基因和番木瓜MLO型基因一起聚类分析，以获得候选的番木瓜抗白粉病基因(图2)。4)番木瓜白粉病基因与已知的植物MLO白粉病基因的比对 利用BioXM 2.6软件将番木瓜候选的MLO型白粉病基因和拟南芥、番茄、豌豆、大麦的MLO白粉病基因的氨基酸序列转换成Fasta格式的文件，将这些文件导入BioEdit 7. O软件，运用此软件中Clustal软件进行多序列比对，掲示候选白粉病基因重要氨基酸残基及区域的保守性。从而进ー步鉴定番木瓜候选的白粉病基因(图3)。本专利技术的积极效果 O缩短了番木瓜白粉病基因挖掘周期，有利于白粉病基因的快速鉴定。采用常规方法(图位克隆、转座子标签等)挖掘抗白粉病基因不仅耗时耗力、效率低，且难以成功。本专利技术基于植物比较基因组学、遗传学、生物信息学方法快速挖掘番木瓜白粉病基因，不仅可以缩短时间，还可以提高白粉病基因鉴定效率。2)番木瓜(Ckrica属于番木瓜科番木瓜属，是广泛种植的重要果树作物之一。由于番木瓜遗传基础狭窄，种质资源多祥性低，因此通过常规的分子标记(RAPD、ISSR、SSR、AFLP等)鉴定番木瓜白粉病基因比较困难。通过鉴定的候选白粉病基因开发相应的共分离功能性标记(SNP、SCAR等)，可以快速的用于抗本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.番木瓜抗白粉病基因，其特征在于选自下列2个基因(片段)或其之一·1、evm.TU. supercontig—53. 58 氨基酸序列VCFFRQFFGSVTKVDYLTLRHGFIAAHLPPGSETKFDFQKYIKRSLEEDFKVVVGISPVIWFIAVLFLLTNTHGWFSYLWFPFIPLIVILLVGAKLQVTITKLGLRIQERGDWKGAPWQP ⑶ DLFWFGRPQFILFLIHLVLFTNAFQLAFFIWATYEFTIRTCFHQRLEDIIIRISMGVLIQVLCSYVTLPLYALVTQMGSTMKPTIFNERVATALKSWRQTAKKHTKHGRNSEATTPFSSRPTTPTHGMSPVHLLHNYNHRSVDSYQNSPRNSNFDNDQWDPEALQNSPGYHEISDSDEAKHSDSLGGQNRPAMAEPVSGQLPPGPAAIRTQREINIGSSEFSFSK 核苷酸序列GTCTGTTTCTTCAGACAGTTCTTTGGATCAGTTACCAAAGTTGATTACCTCACACTCAGACATGGATTTATCGCGGCACATTTGCCACCCGGTAGCGAAACCAAATTCGATTTCCAGAAGTACATTAAGAGATCATTAGAAGAGGATTTCAAAGTTGTGGTGGGGATCAGTCCTGTTATCTGGTTCATTGCTGTATTGTTTCTTCTAACTAATACTCATGGATGGTTTTCATATCTTTGGTTCCCATTTATCCCCTTAATTGTAATTTTGCTGGTTGGAGCCAAACTTCAAGTTACAATAACAAAATTGGGATTGAGGATTCAAGAGAGGGGAGATGTGGTTAAAGGCGCTCCAGTTGTCCAGCCCGGAGACGATCTTTTCTGGTTCGGACGTCCTCAATTTATCCTCTTCTTAATTCATCTCGTACTCTTTACGAATGCATTTCAGCTTGCTTTCTTCATCTGGGCAACGTACGAGTTTACCATAAGAACCTGCTTCCACCAACGATTGGAAGATATCATTATTAGAATCTCCATGGGGGTCCTCATACAGGTTCTTTGTAGTTACGTGACTCTGCCTCTCTACGCACTTGTGACCCAGATGGGATCGACAATGAAACCTACAATTTTCAACGAGAGAGTAGCAACGGCACTTAAAAGTTGGCGTCAAACAGCAAAGAAACACACGAAACACGGTAGGAATTCCGAGGCTACGACGCCATTTTCTAGCCGGCCAACAACTCCTACCCACGGCATGTCACCAGTTCATCTCTTGCACAATTACAATCACCGCAGTGTTGACAGCTACCAAAACTCTCCGAGGAATTCCAACTTCGACAACGATCAATGGGATCCCGAGGCGTTGCAAAATTCTCCGGGATATCACGAGATAAGTGACTCCGATGAAGCCAAACATTCGGATAGTCTTGGAGGACAAAATAGGCCAGCAATGGCAGAACCAGTCTCCGGTCAGCTGCCTCCGGGGCCTGCTGCTATTAGGACGCAACGAGAAATCAATATAGGTTCATCAGAATTCAGCTTCAGCAAGTGA·2、evm.TU. supercontig_435. 5 氨基酸序列MAGASGGRSLEETPTWAVAVVCFVLVFISICIEYIFHLIGKWLKKKRKRALYESLEKIKSELMLMGFVSLLLTVGQGLISNICIPKSIGATWHPCNKKQEEESEKVDDDSDLEHRRRLLSAVTHSGEGFRRVLAAASTDKCAEKGKVPFVSEEGIHQLHIFIFVLAVSHVLYCIITMALGRAKMRSWKSWEKETRTVEYQFSHDPERFRFARETSFGRRHLSFWTKTPVFIWIVCFFRQFVRSVPKVDYLTLRHGFITAHLAPQSHTKFDFQKYINRSLEEDFKVVVGISPPIWFFAVLFLLFNTHGffYSYLffLPFIPLIIILLVGTKLQVIITKMGLRIQERGEVVKGVPVVQP⑶DLFWFNRPRLILFLINFVLFQNAFQLAFFAWTWYEFGIKSCFHENVEDIVIRISMGVLIQILCSYVTLPLYALVTQMGSNMKPTIFNE...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱孝英，俞锞，
申请(专利权)人：常熟市支塘镇新盛技术咨询服务有限公司，
类型：发明
国别省市：