本发明专利技术公开了一种甘蓝型油菜耐湿性改良的方法，其步骤：A、构建含vgb的抗草胺磷表达载体：（1）目的片段获得；（2）PCR产物回收、转化及测序；（3）T-DNA制备；（4）Vector制备；（5）表达载体制备；（6）农杆菌菌液制备；B、选育耐湿甘蓝型油菜恢复系：通过农杆菌介导法将vgb转到R2中得到T0代恢复系，连续自交后得到T2代恢复系；C、选育耐湿甘蓝型油菜保持系：（a）通过农杆菌介导法将vgb转到6098B中得到T0代保持系，再自交得到T2代保持系；（b）以得到的T1代恢复系单株为父本与6098B杂交，再以6098B为轮回亲本连续回交得到BC3代，再自交得到T2代保持系；D、获得耐湿甘蓝型油菜不育系。方法易行，操作简便，效果明显，能够降低成本并缩短育种进程。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于油菜品质育种和油菜转基因育种领域，更具体涉及，它适用于一种甘蓝型油菜耐湿性育种。
技术介绍
土壤水分长时间处于饱和状态会极大影响作物生长。长江流域是中国油菜主要产区，约占全国油菜产量的3/4，但该区域雨水偏多，常超过油菜正常需水量，加之该地区油菜生产主要采用水旱轮作尤其是稻茬免耕的种植模式，土壤黏重，透气性差，排水困难，地下水位高，因此极易产生湿(溃)害，影响油菜正常生长，导致产量下降。前人研究表明，油菜在湿害胁迫下，株高、茎粗、根粗、根长、绿叶数、叶面积、干重等均明显降低，有效分枝数、单株角果数和粒数大幅下降，油菜因此可能减产17%-42.4% (Zhouff J, LinXQ(1995)Effects of waterlogging at different growth stages on physiologicalcharacteristics and seed yield of winter rape(Brassica napus L·)· Field CropsResearch, 44:103-110;Gutierrez B F H, Lavado R S,Porcelli C A(1996)Note on theeffects of winter and spring waterlogging on growth, chemical compositionand yield ofrapeseed. Field Crops Research, 47:175-179;Leul M, Zhou W J(1998)Alleviation of waterlogging damage in winter rape by application of uniconazoleeffects on morphological characteristics, hormones and photosynthesis.FieldCrops Research, 59:121-127)。为减轻油菜湿害带来的产量损失，生产上一般采用开沟排水降低地下水位、土壤翻耕和中耕等农艺措施，但需要花费大量的劳动成本，随着以直播免耕为主的油菜轻简化栽培技术大力推广，为降低油菜生产成本，选育耐湿强的直播油菜品种成为重要的育种目标之一。传统耐湿性育种依赖于准确可靠的耐湿性评价方法及鉴定指标，以分子标记辅助选择为基础的耐湿性育种依赖于耐湿性状的深入研究，包括耐湿性状遗传模式分析、定位群体构建、分子标记筛选、QTL定位、QTL克隆、候选基因功能分析及耐湿基因应用等。随着现代农业对油菜品种的要求的多元化，油菜耐湿性育种将成为研究热点，但是目前油菜耐湿性研究还远远不够，油菜耐湿性育种依然面临诸多困境，比如发芽期鉴定油菜耐湿性是否准确，耐湿性鉴定成本较大，QTL定位是否准确，分子标记能否利用等等。转基因技术是现代生物技术的核心，运用该技术能够培育抗病虫、抗逆、优质、高产、高效等新品种。抗病、抗虫性育种方面，菲律宾国际水稻研究所，已育成一批抗稻瘟病、病毒病、白叶枯病、稻飞虱、稻叶蝉和二化螟等多抗品种，如IR36、IR64，美国孟山都公司通过转基因方法育成抗虫、抗旱和抗草胺磷玉米品种，我国广东育成的窄叶青水稻品种高抗稻瘟病，中国农科院利用转基因技术育成抗棉铃虫棉花品种。品质育种方面，美国培育出玉米品种“U-24”，蛋白质含量高达20%，赖氨酸含量达5%，菲律宾国际水稻研究所育成IR20、 IR22、IR24等一批高产优质品种，蛋白质含量比一般品种提高2%，浙江省农业科学院应用反义PEP转基因技术育成双低、高油油菜新品系超油I号(47.4%)、超油2号(52. 82%)。传统杂交育种技术只能在相同生物物种内进行基因转移，转基因技术则不受生物物种生殖隔离限制，可以在不同物种间转移基因，因此可以借助其他物种的某些特殊基因来改良农作物的品质，比如将鱼的抗寒蛋白基因转到农作物中提高抗寒性。透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin, VHb)是在透明颤菌属(Vitreoscilla sp. Cl)中产生的一种可溶性血红蛋白。研究显示，vgb (编码透明颤菌血红蛋白的基因)的表达能增强植株耐湿性。Ma o等(2003)通过农杆菌介导方法将vgb转化到矮牵牛中，在大田条件下种植鉴定了转基因的矮牵牛植株，发现这些植株显示出了明显的耐 劳性(Mao Ζ, Hu Y. Zhong J, Wang L, Guo J and Lin Z (2003) Improvement of hydroponicgrowth and water tolerance of Petunia by the introduction of vhb gene. ActaBotanica Sinica 45:205-210) 等(2005)用下胚轴和子叶柄作为浸染外植体，运用农杆菌介导法将vgb转移到卷心菜(Brassica oleracea var. Cabitata)中，发现转基因种子比野生对照发芽快，并且转基因植株在持续淹水处理下显示一定忍耐力(Li X, Peng RH, FanHQ, Xiaong AS, Yao QH, Cheng ZM, Li Y(2005)Vitreoscilla hemoglobin overexpressionincreases submergence tolerance in cabbage. Plant Cell Rep 23:710-715)。李义良等(2009)对导入vgb的银腺杂种杨进行耐 劳性鉴定，结果表明，淹水胁迫下vgb的表达增强了银腺杂种杨叶绿素含量的积累，进而促进了转基因植株的生长，提高了转基因株系对淹水环境的忍受能力(李义良，苏晓华，张冰玉，黄秦军，张香华.转vgb银腺杂种杨的耐涝性·林业科学，2009, 45(7) :26-31)。Zelasco等(2006)将vgb转到白杨树中发现，植株生长、生物总量、淹水忍耐力和氧化压力、亚硝基应激压力的忍耐力不完全依赖VHb的特殊功能,于是认为转基因杨树中vgb表达的影响并不确定(Zelasco S，ReggiS，Calligari P, Balestrazzi A, Bongiorni C，Quattrini E, Delia G, Bisoffi S，FogherC, Confalonieri M(2006)Expression of the Vitresocilla hemoglobin (VHb) encodinggene in transgenic white poplar:plant growth and biomass production, biochemicalcharacterization and cell survival under submergence, oxidative and nitrosativestress conditions. Mol Breed 17:201-216),因此vgb表达能否增强其他植物(包括油菜)的耐湿性还有待进一步研究。尽管谭小力等曾将蓝细菌血红蛋白基因转入到甘蓝型油菜中(谭小力，本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种甘蓝型油菜耐湿性改良的方法，其步骤是 A、含vgb的抗草胺磷表达载体的构建 (O目的片段获得以NCBI网站上公布的序列为模板设计引物，以质粒DNA为底物进行PCR扩增； (2)PCR产物回收、转化及测序回收PCR扩增片断，将片段连入Simple-T vecter中，转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，通过篮白斑筛选获得阳性单克隆，挑选阳性克隆，繁殖菌液,送样测序； (3)T-DNA制备与NCBI网站上公布的vgb序列的编码区做比较，挑选没有碱基差异的阳性单克隆菌液，抽取质粒DNA，双酶切后回收酶切片段得到T-DNA ； (4)Vector制备繁殖菌液包含NPTII表达元件、Bar表达元件的大肠杆菌菌液，抽取质粒DNA，双酶切后回收酶切片段得到Vector ； (5)表达载体制备连接步骤(3)得到的T-DNA和步骤(4)得到的Vector,转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，挑取单克隆，繁殖菌液，抽取质粒DNA ； (6)农杆菌菌液制备将步骤(5)得到的质粒DNA转化农杆菌LBA4404感受态细胞，挑取单克隆，繁殖菌液，即得到后续工作中所需要的包含NPT II表达元件、Bar表达元件和vgb的农杆菌菌液； B、抗草胺磷耐湿甘蓝型油菜恢复系的获得 通过农杆菌介导法将vgb转化到R2或R6中得到Ttl代植株；室内分子标vhb5’ /vhb3’ 5’GCAATCACGCCATAAGCCT3’鉴定或田间草胺磷鉴定得...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈玉峰，胡琼，李云昌，梅德圣，刘佳，付丽，李英德，徐育松，李晓琴，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：
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