本发明专利技术提供了一种安全高效的巨尾桉遗传转化方法，以便解决现有技术中所述农杆菌介导法转化桉树所遇到的问题。本发明专利技术通过构建以安全性标记基因PMI(6-磷酸甘露糖异构酶)为筛选标记的表达载体，通过大量的组培试验及对遗传转化方法的改进，最终将目的基因AmCBL1成功转入巨尾桉中。该目的基因来源于超旱生植物沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus(Maxim.)Cheng?f.)，由其特异性启动子AmCBL1P所驱动。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种桉树转化方法，特别是巨尾桉转化方法。
技术介绍
桉树是桃金娘科Myrtaceae桉属Eucalyptus植物的统称,常绿乔木,为世界三大速生造林树种之一。桉树原产于澳洲，广泛分布于热带、亚热带地区，具有速生丰产、适应性广等特点。在我国，桉树主要分布于海南、福建及两广地区，是我国南方应用最广的造林及经济树种。然而，在中亚热带地区，低温冻害是按树引种、扩大栽培与速生丰产的主要限制因子。因此，按树的抗寒品种选育，尤其选择适合我国既耐寒、经济价值又高的优良按树种/种源向北推移，扩大引种栽培范围，加快按树产业的发展就成为育种的重要目的之一。1991年Teulieres C等首次在冈尼桉(Eucalyptus gunnii)原生质体上、转化报告基因，目前已对冈尼桉、朽1檬桉(E. citriodora)、蓝桉(E. globulus)、赤桉(E. camaldulensis)、巨桉(E. grandis)、尾叶桉(E. urophylla)等进行了遗传转化的研究。另外，近年来桉树高效再生体系的建立、高密度基因图谱构建以及分子标记的快速发展为桉树转基因研究提供了条件和依据。传统的农杆菌介导转化法在桉树的转基因研究中是比较有效的方法之一，目前通过根癌农杆菌介导法已经对巨桉、邓恩桉、亮果桉、赤桉、巨尾桉和尾巨桉等10几种桉树中进行了转基因研究。但它仍旧面临着转化效率较低、再生技术的限制(只在赤桉、巨桉等少数几个种中有转基因植株的报道，在其它桉树品种中报道较少)、外源基因表达的时空调控、转基因植株对环境的生物安全性等诸多问题。因此，探索改良新的转化体系，提高转化效率成为桉树转基因技术是否可以将理论研究付诸于造林应用的一个重要内容。甘露糖磷酸异构酶(phosphomannose isomerase,PMI)基因在自然界中广泛存在，而除肉桂(Cinnamomum cassia)和一些豆类外，自然界的植物中大都没有编码PMI的基因。因而以甘露糖为筛选剂的正向筛选系统在包括桉树在内的绝大多数植物的遗传转化中都是可用的。PMI作为一种正向筛选标记，其本身对植物是无害的。当培养基中加入适当比例的甘露糖/蔗糖时，转化植株可以将甘露糖转化为6-磷酸果糖，作为碳源供植株生长；而非转化植株则会因为碳源的缺乏呈现出相对的生长劣势，继而与转基因植株区分开来。另夕卜，与以住的除草剂、抗生素相比，PMI标记基因的生物安全性得以保障，这一点对于作为造林树种的桉树尤为重要。而且，将安全性标记基因PMI应用于桉树的研究目前国内国际均未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种安全高效的巨尾桉遗传转化方法，以便解决现有技术中所述农杆菌介导法转化桉树所遇到的问题。本专利技术通过构建以安全性标记基因PMI (6-磷酸甘露糖异构酶)为筛选标记的表达载体，通过大量的组培试验及对遗传转化方法的改进，最终将目的基因AmCBLl成功转入巨尾桉中。该目的基因来源于超旱生植物沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus (Maxim.) Cheng f.),由其特异性启动子 AmCBLlP 所驱动，该启动子功能已经验证。本专利技术的目的是通过如下方式实现的，包括以下步骤(I)将目的基因连入含有6-磷酸甘露糖异构酶(PMI)的表达载体pCAMBIA1301上，将所述载体导入根癌农杆菌EHA105 ； (2)将所述农杆菌于含有100mg/mL卡那霉素和50mg/mL利福平的YEB培养基中，28°C, 180转/分钟，避光摇至OD值为O. 4 O. 6 ；8000转/分钟，离心10分钟，沉淀收集菌体；(3)使用含有乙酰丁香酮(Acetosyringone,以下简称AS) 50mg/L、2-(N_吗啡啉)乙磺酸150mg/L和半乳糖I. 8g/L的无鹿糖MS液体培养基悬浮菌体,悬浮后的菌液OD值仍调至0. 4 0. 7 ;(4)取巨尾桉组培苗茎段，剪为0. 5厘米左右，接种于预培养愈伤诱导培养基中，在温度为25±2°C的培养室中，暗培养I天，进行预培养；(5)取悬浮后的菌液侵染经预培养的巨尾桉茎段，侵染时间为4 7分钟；侵染后接种至共培养愈伤诱导培养基中，在温度为25±2°C的培养室中，暗培养3天中，进行共培养;(6)将共培养后的茎段转接至筛选阶段的愈伤诱导培养基中，在温度为25±2°C的培养室中，暗培养40 45天，进行选择性培养；(7)统计选择性培养后的愈伤组织诱导率，将产生的愈伤组织接至筛选阶段的分化培养基中，在光照强度为1500 2000勒克斯、光周期为18小时/天、温度为25±2°C的培养室内进行芽分化培养；(8)约25 30天后，将分化得到的芽编号，并移入新的筛选阶段的分化培养基中继续进行分化培养；(9)取分化培养中高约2厘米左右的小芽，接入筛选阶段的生根培养基中，在光照强度为1500 2000勒克斯、光周期为18小时/天、温度为25±2°C的培养室内进行生根培养，40 45天后将生根巨尾桉幼苗移入土中；(10)取经筛选培养得到的巨尾桉株系叶片进行氯酚红检测，转化成功的株系的检测液产生变色反应；用转化成功的株系提取DNA，以AmCBLl基因正向引物AmCBLl-I和反向引物AmCBLl-2为引物，经PCR反应进行转基因鉴定，确定这些株系的DNA中是否获得了目的基因。其中，所述目的基因是AmCBLl基因，所述目的基因来源于超旱生植物沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus (Maxim.) Cheng f.)，该基因由其特异性启动子 AmCBLlP所驱动。所述悬浮后的菌液OD值优选仍调至0. 5 0. 6。所述侵染时间优选为5 6分钟。所述预培养愈伤诱导培养基是含苯基噻二唑脲(Thidiazuron,以下简称TDZ)0. 5mg/L、蔡乙酸(1-naphthlcetic acid,以下简称 NAA)0. lmg/L、鹿糖 30g/L 和琼脂7g/L的MS培养基。所述共培养愈伤诱导培养基是含羧苄青霉素(Carbenicillin，以下简称Car) 200mg/L、TDZ O. 5mg/L、NAA O. lmg/L、蔗糖 30g/L 和琼脂 7g/L 的 MS 培养基。所述筛选阶段的愈伤诱导培养基是含有Car 200mg/L、TDZ O. 5mg/L、NAA O. lmg/L、蔗糖19g/L、甘露糖llg/L和琼脂7g/L的MS培养基。所述筛选阶段的分化培养基中是含有Car 200mg/L、蔗糖19g/L、甘露糖llg/L和琼脂7g/L的MS培养基。 所述筛选阶段的生根培养基是含有Car 200mg/L、IBA O. 5mg/L、NAA O. 5mg/L、蔗糖19g/L、甘露糖llg/L和琼脂7g/L的1/2MS培养基。AmCBLl 基因正向引物 AmCBLl-I 的序列为ATGGGGTGCT TCAACTCTAA反向引物AmCBLl-2 为引物的序列为TCAAGCAGCA ACTTCATCC组培基础I.巨尾桉的愈伤诱导敏感性试验为获得巨尾桉愈伤组织诱导所最适宜的生根培养基配方，本实验选用TDZ与NAA，按以下激素配比配制愈伤组织诱导培养基表I培养基茎段叶片TDZ(mg/L)NAA(mg/L)愈伤_^^_0.1正常4/10本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种巨尾桉转化方法，包括以下步骤 (1)将目的基因连入含有6-磷酸甘露糖异构酶(PMI)的表达载体PCAMBIA1301上，将所述载体导入根癌农杆菌EHA105 ； (2)将所述农杆菌于含有100mg/mL卡那霉素和50mg/mL利福平的YEB培养基中，28°C，180转/分钟，避光摇至OD值为O. 4 O. 6 ；8000转/分钟，离心10分钟，沉淀收集菌体； (3)使用含有乙酰丁香酮50mg/L、2-(N-吗啡啉)乙磺酸150mg/L和半乳糖I.8g/L的无蔗糖MS液体培养基悬浮菌体，悬浮后的菌液OD值仍调至O. 4 O. 7 ; (4)取巨尾桉组培苗茎段，剪为O.5厘米左右，接种于预培养愈伤诱导培养基中，在温度为25±2°C的培养室中，暗培养I天，进行预培养； (5)取悬浮后的菌液侵染经预培养的巨尾桉茎段，侵染时间为4 7分钟；侵染后接种至共培养愈伤诱导培养基中，在温度为25 ± 2°C的培养室中，暗培养3天中，进行共培养； (6)将共培养后的茎段转接至筛选阶段的愈伤诱导培养基中，在温度为25±2°C的培养室中，暗培养40 45天，进行选择性培养； (7)统计选择性培养后的愈伤组织诱导率，将产生的愈伤组织接至筛选阶段的分化培养基中，在光照强度为1500 2000勒克斯、光周期为18小时/天、温度为25±2°C的培养室内进行芽分化培养； (8)约25 30天后，将分化得到的芽编号，并移入新的筛选阶段的分化培养基中继续进行分化培养； (9)取分化培养中高约2厘米左右的小芽，接入筛选阶段的生根培养基中，在光照强度为1500 2000勒克斯、光周期为18小时/天、温度为25±2°C的培养室内进行生根培养，40 45天后将生根巨尾桉幼苗移入土中； (10)取经筛选培养得到的巨尾桉株系叶片进行氯酚红检测，转化成功的株系的检测液产生变色反应；用转化成功的株系提取DNA，...
【专利技术属性】
技术研发人员：夏新莉，尹伟伦，庞涛，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：
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