AXMI-205杀虫基因和它的使用方法技术

提供了赋予对细菌、植物、植物细胞、组织和种子的杀虫活性的组合物和方法。提供了包含杀虫多肽的编码序列的组合物。所述编码序列可以用于DNA构建体或者表达盒中用于在植物和细菌中的转化和表达。组合物也包含转化的细菌、植物、植物细胞、组织和种子。特别地，提供了分离的杀虫核酸分子。此外，包含了相应于所述多核苷酸的氨基酸序列。特别地，本发明专利技术提供了核酸分子，其包含编码在SEQ?ID?NO：2，3，或者4中显示的氨基酸序列的核苷酸序列，在SEQ?ID?NO：1，9，10或者11中给出的核苷酸序列以及它们的变体和片段。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】AXMI-205杀虫基因和它的使用方法对相关申请的交叉参考本申请要求在2009年7月2日提交的美国临时申请系列号61/222,778的权益，所述临时申请的内容完整并入本文作为参考。专利
本专利技术涉及分子生物学领域。提供了编码杀虫蛋白的新基因。这些蛋白质和编码它们的核酸序列可用于制备杀虫制剂和生产转基因抗虫植物。专利技术背景DDT(二氯-二苯基-三氯乙烷)的引入和随后向合成化学杀虫剂滥用的发展导致水和食品来源的污染、非靶标有益昆虫的被毒害和昆虫害虫对化学杀虫剂抗性的发展。在化学杀虫剂的滥用对环境的不利影响上增加的公众关注推动了寻找用于昆虫害虫控制的备选方法。一种有希望的备选方案已经是使用生物学控制剂。有Bt(苏云金芽孢杆菌，一种革兰氏阳性土壤细菌)作为有效的生物杀虫剂的安全应用的详实记录并且可得到δ-内毒素基因在农作物植物中表达的很多报告。Bt转基因农作物只需要很少的杀虫剂喷雾，这不仅节约成本和时间，还减少了健康风险。在一些情况下，昆虫可以发展出对不同的杀虫剂化合物的抗性，所述抗性增加了鉴定用于害虫控制的备选生物学控制剂的需要。专利技术概述提供了赋予细菌、植物、植物细胞、组织和种子的杀虫活性的组合物和方法。组合物包括编码杀害虫和杀昆虫多肽序列的核酸分子、包含这些核酸分子的载体和包含该载体的宿主细胞。组合物也包括杀虫多肽序列和这些多肽的抗体。所述核苷酸序列可用于DNA构建体或者表达盒中用于在生物包括微生物和植物中的转化和表达。该核苷酸或者氨基酸序列可以是合成序列，其已经被设计用于在生物，包括但不限于微生物或植物中表达。组合物也包含转化的细菌、植物、植物细胞、组织和种子。特别地，提供了编码杀虫蛋白的分离的或者重组的核酸分子。此外，包含了相应于杀虫蛋白的氨基酸序列。特别地，本专利技术提供分离的核酸分子，其包含编码在SEQIDNO：2，3，4，5，6，7或者8中显示的氨基酸序列的核苷酸序列，或者在SEQIDNO：1，9，10或者11中给出的核苷酸序列以及它们的变体和片段。也包含与本专利技术的核苷酸序列互补的核苷酸序列或者与本专利技术的序列杂交的序列。提供了产生本专利技术的多肽和使用这些多肽来控制或者杀死鳞翅目害虫、鞘翅目害虫、线虫或者双翅目害虫的方法。也包括检测样品中本专利技术的核酸和多肽的方法和试剂盒。本专利技术的组合物和方法在产生具有增强的害虫抗性或者耐受性的生物中是有用的。这些生物和组合物包含期望用于农业目的的生物。本专利技术的组合物对于产生具有杀虫活性的改变的或者改进的蛋白质，或者对于检测产品或者生物中杀虫蛋白或者核酸的存在也是有用的。附图简述图1显示了AXMI-205(SEQIDNO：2)与来自发光光杆状菌(Photorhabdusluminescens)(SEQIDNO：14)和密执安棍状杆菌(Clavibactermichiganensis)(SEQIDNO：15)的MACPF蛋白的比对。专利技术详述本专利技术涉及在生物特别是植物或者植物细胞中调节害虫抗性或者耐受性的组合物和方法。“抗性”意指害虫(例如昆虫)在摄食或者与本专利技术的多肽接触时被杀死。“耐受性”意指害虫的运动、进食、繁殖或者其他功能的损伤或者减弱。所述方法涉及用编码本专利技术的杀虫蛋白的核苷酸序列转化生物。特别地，本专利技术的核苷酸序列可用于制备具有杀虫活性的植物和微生物。因此，提供了转化的细菌、植物、植物细胞、植物组织和种子。组合物是细菌种类的杀虫核酸和蛋白质。所述序列可用于表达载体的构建中用于随后转化到目的生物中，作为探针用于分离其他同源的(或者部分同源的)基因，或者通过本领域已知的方法如结构域交换或者DNA改组用于产生改变的杀虫蛋白。蛋白质可用于控制或者杀死鳞翅目、鞘翅目、双翅目和线虫类害虫种群并且用于产生具有杀虫活性的组合物。“杀虫毒性”或者“杀虫蛋白”意指对一种或者多种害虫具有毒性活性的毒素或者与此种蛋白质具有同源性的蛋白质，所述害虫包括但不限于鳞翅目、双翅目和鞘翅目或者线虫纲的成员。已经从生物包括例如芽孢杆菌属(Bacillussp.)、双酶梭菌(Clostridiumbifermentans)和波林芽孢杆菌(Paenibacilluspopilliae)中分离出杀虫蛋白。杀虫蛋白包括从本文公开的全长核苷酸序列推导的氨基酸序列和比全长序列更短的氨基酸序列，这是由于使用备选的下游起始位点或者由于加工产生了较短的具有杀虫活性的蛋白质。加工可以在表达该蛋白质的生物中发生或者在摄食该蛋白质后在害虫中发生。因此，本文提供的是赋予杀虫活性的新分离的或者重组的核苷酸序列。也提供了杀虫蛋白的氨基酸序列。从该基因的翻译得到的蛋白质允许细胞控制或者杀死摄食它的害虫。分离的核酸分子以及它们的变体和片段本专利技术的一个方面涉及分离的或者重组的核酸分子，其包含编码杀虫蛋白和多肽或者它们的生物学活性部分的核苷酸序列以及足够用作杂交探针的核酸分子，所述探针用于鉴定编码具有序列同源性区域的蛋白质的核酸分子。此处使用的术语“核酸分子”意在包括DNA分子(例如重组DNA、cDNA或者基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及使用核苷酸类似物产生的DNA或者RNA类似物。核酸分子可以是单链或者双链的，但优选地是双链DNA。此处使用的“分离的”核酸序列(或者DNA)指的是不再处于它的天然环境中的核酸序列(或者DNA)，例如在体外或者在重组的细菌或者植物宿主细胞中。在一些实施方案中，“分离的”核酸不含在该核酸来源的生物基因组DNA中天然位于该核酸侧翼(即位于该核酸的5’和3’末端的序列)的序列(优选地蛋白质编码序列)。为本专利技术的目的，当使用“分离的”时指的是除了分离的染色体以外的核酸分子。例如，在多种实施方案中，编码杀虫蛋白的分离的核酸分子可以含有少于约5kb，4kb，3kb，2kb，1kb，0.5kb或者0.1kb的核苷酸序列，所述核苷酸序列在核酸来源的细胞的基因组DNA中天然地位于该核酸分子的侧翼。基本上不含细胞物质的杀虫蛋白包括蛋白质制剂，其具有少于约30％，20％，10％，或者5％(以干重计)的非杀虫蛋白(此处也指作“污染蛋白质”)。编码本专利技术的蛋白质的核苷酸序列包括在SEQIDNO：1，9，10或者11中给出的序列，和它们的变体、片段和互补序列。“互补序列”意指核苷酸序列，其与给定的核苷酸序列足够互补以致它能与该给定的核苷酸序列杂交从而形成稳定的双链体。在SEQIDNO：2，3或者4中给出了此种核苷酸序列编码的杀虫蛋白的相应的氨基酸序列。本专利技术也包含编码杀虫蛋白的这些核苷酸序列的片段的核酸分子。“片段”意指编码杀虫蛋白的核苷酸序列的部分。核苷酸序列的片段可以编码杀虫蛋白的生物学活性部分，或者它可以是使用在下文公开的方法可用作杂交探针或者PCR引物的片段。编码杀虫蛋白的核苷酸序列的片段的核酸分子包含至少约50个，100个，200个，300个，400个，500个，600个，700个，800个，900个，1000个，1100个，1200个，1300个，1350个，1400个，1450个，1500个，1550个，1600个连续核苷酸，或者多达编码本文公开的杀虫蛋白的全长核苷酸序列中存在的核苷酸数目，所述核苷酸的数目取决于预期的用途。“连续的”意指彼此直接相邻的核苷酸残基。本专利技术的核苷酸序列的片段将编本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.07.02 US 61/222,7781.重组核酸分子，其由选自由以下序列组成的组的核苷酸序列组成：a)SEQIDNO:1的核苷酸序列，或者其互补序列；和b)编码SEQIDNO:2,3,4,5,6,7或者8中任一个的氨基酸序列的核苷酸序列；c)核苷酸序列，其编码SEQIDNO:2的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列通过在SEQIDNO:2的307－536的区域之间进行保守氨基酸取代而被改变，所述氨基酸取代为S307A、D315A、V317A、S349A、G351A、K353A、V355A、D395A、G399A、W407A、G419A、P355A、P435A、S443A、K465A、V467A、F483A、P487A、S495A、D497A、E499A、K509A,或I513A；和d)核苷酸序列，其编码SEQIDNO:2的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列通过在SEQIDNO:2的C-末端区的1,2,3,4,5,6,7,8,9,或10个氨基酸缺失或截短而被改变。2.权利要求1的重组核酸分子，其中所述核苷酸序列是已经设计用于在植物中表达的合成序列。3.权利要求2的重组核酸分子，其中所述核苷酸序列选自SEQIDNO:9,10，11或12。4.权利要求1的重组核酸分子，其中所述核苷酸序列与能够在植物细胞中指导所述核苷酸序列表达的启动子有效连接。5.权利要求4的重组核酸分子，其进一步地包含编码异源多肽的核苷酸序列。6.含有权利要求4的重组核酸分子的宿主细胞。7.权利要求6的宿主细胞，其是细菌宿主细胞。8.具有杀虫活性的重组多肽，其选自：a)由SEQIDNO:2,3,4,5,6,7或者8中任一个的氨基酸序列组成的多肽；b)SEQIDNO:1的核苷酸序列编码的多肽；c)多肽，其由SEQIDNO:2的氨基酸序列组成，其中所述氨基酸序列通过在SEQIDNO:2的307－536的区域之间进行保守氨基酸取代而被改变，所述氨基酸取代为S307A、D315A、V317A、S349A、G351A、K353A、V355A、D395A、G399A、W407A、G419A、P355A、P435A、S443A、K465A、V467A、F483A、P487A、S495A、D497A、E499A、K509A,或I513A；和d)多肽，其由SEQIDNO:2的氨基酸序列组成，其中所述氨基酸序列通过在SEQIDNO:2的C-末端区的1,2,3,4,5,6,7,8,9,或10个氨基酸缺失或截短而被改变。9.权利要求8的多肽，其进一步包含异源氨基酸序列。10.包含权利要求8的多肽的组合物。11.权利要求10的组合物，其中所述组合物选自粉剂、粉尘剂、弹丸剂、粒剂、喷雾剂、乳剂、胶体剂和溶液剂。12.权利要求10的组合物，其中所述组合物通过苏云金芽孢杆菌细胞培养物的干燥、匀浆、提取、过滤、离心、沉降或浓缩制备。13.权利要求10的组合物，其包含按重量计1％至99％的所述多肽。14.控制西方玉米根虫种群的方法，其包括将所述种群与杀虫有效量的权利要求8的多肽接触。15.杀死西方玉米根虫的方法，其包括让所述西方玉米根虫接触或者进食杀虫有效量的权利要求8的多肽。16.生产具有杀虫活性的多肽的方法，其包括在编码所述多肽的核酸分子表达的条件下培养权利要求6的宿主细胞。17.保护植物免于西方玉米根虫伤害的方法，所述方法包括在植物或者其细胞中表达编码杀虫多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自以下序列组成的组：a)SEQIDNO:1,9,10,11或者12的核苷酸序列；b)编码SEQIDNO:2,3...

【专利技术属性】
技术研发人员：N·德赛，J·辛森，D·巴鲁萨布瑞曼尼安，K·S·桑普森，D·J·汤姆索，D·A·莱特宁，N·B·达克，
申请(专利权)人：阿森尼克斯公司，
类型：发明
国别省市：