经由体细胞胚胎发生的质体遗传工程制造技术

本发明专利技术公开了适宜转化非绿色植物细胞的质体转化载体，其中质体载体包含可操作连接的元件——第一侧翼序列、编码外源基因的DNA序列和第二侧翼序列。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利
涉及植物质体遗传工程。更具体的是，本专利技术涉及通过质体转化来转 化非绿色植物细胞，以及随后通过体细胞胚胎发生来再生非绿色植物细胞。
技术介绍
因为具有若干有吸引力的有利条件，包括高水平的转基因表达(Daniell等人，2002)、单一转化事件中的多基因改造(DeCosa等人，2001 ;Ruiz等人，2003 ;Daniell &Dhingra，2002)、经由母系遗传的转基因限制(Daniell2002)、基因沉默的缺乏(Lee等人，2003 ;DeCosa等人，2001)、位点特异的转基因整合导致的位置效应(Daniell等人，2002)和多重效应(Daniell等人，2001 ；Lee等人，2003)，因此质体对于遗传工程而言是理想的。叶绿体遗传工程最适合高表达疫苗抗原和生产有价值的治疗蛋白质。自从我们展示了用于各种生物医学用途的人弹性蛋白衍生聚合物的表达(Guda等人，2000)，我们已将这一方法拓展到表达霍乱、炭疽的疫苗抗原(Daniell等人，2001，Daniell 2003)、单克隆抗体(Daniell等,2001)和人的治疗蛋白质,包括人血清白蛋白(Fernandez等,2003)、爪蟾抗菌肽(DeGray 等，2001)、干扰素(Daniell，2003)和胰岛素样生长因子(Daniell，2003)。一些别的实验室已经在转基因叶绿体中表达了人生长激素干扰素-GUS (Human SomatotropinInterferon-GUS)融合蛋白质来提高稳定性(Reddy等人,2003)并在转基因叶绿体中表达了破伤风疫苗抗原(Tregoning等人,2003)。毫无例外,所有这些治疗蛋白质都被表达于转基因烟草叶绿体中，符合各种环境团体针对用于植物来源药物的食品作物倡仪的零容许度(zero-tolerance)。然而，迫切需要治疗性蛋白质和疫苗抗原的口服递送来大大降低它们的生产、纯化、储存和运输成本，并最小化与静脉给药相关的并发症。因为饮食中胡萝卜是优异的糖、维生素A、C和纤维的来源，胡萝卜(Daucus carota L.)成为全球范围内人和动物食用的最重要的蔬菜之一。胡萝卜是两年生植物，在两年内完成其生命周期。在第一年植物产生可食的肉质主根。如果将其留在地里，在经过一个寒冷的季节后，植物于第二年开花(Yan，W. & Hunt，LA Reanalysis of Vernalization Data of Wheat and Carrot，Annals ofBotany 84，615-619 (1999))。另外，种植的胡萝卜作物的叶绿体基因组严格通过母系遗传传递(Vivek等人1999)。因此，胡萝卜在环境上是安全的，并且通过双重保护阻止了转基因经由花粉和种子的流动，从而符合对食品作物中的转基因流动提出的零容许度倡仪。胡萝卜体细胞胚是单细胞来源的，通过循环的胚胎发生扩增；这提供了一致的细胞培养物来源，这一点是生产治疗蛋白质的必要条件之一(均一单一来源)。使用生物反应器，胡萝卜细胞迅速分裂并产生大量的生物量。培养的胡萝卜细胞是可食的，并可以被直接用于递送精确剂量的疫苗抗原或生物药物。当经由可食胡萝卜进行给药时不需要烹饪，这将保持治疗蛋白质在食用过程中的结构完整性。在培养基中能长期生存的、包裹的胚可以作为人工种子用于低温储藏和有控制的萌发(Tessereau, H.，B. Florin, M. C. Meschine, C. Thierry和V. Petiard，1994)。因此，具有增加的医学或营养价值的转基因胡萝卜能够在改善人或动物的健康方面扮演至关重要的环节。然而，要改造胡萝卜基因组必须克服几个主要的障碍。迄今为止，仅使用过含有大叶绿体的绿叶作为外植体来转化叶绿体基因组。第一个挑战是向小的前质体引入外源DNA并鉴定在非绿色质体中具有功能的适当的调节序列和选择标记。第二个挑战是经由体细胞胚胎发生再生叶绿体转基因植物并实现同质性(homoplasmy)，这一点不具有当使用叶作为外植体时由器官发生提供的可以进行随后循环选择的好处。由于这些原因，叶绿体遗传工程仅在除烟草之外的一些茄科作物中被完成，如番茄(Ruf等人，2001)和马铃薯(Sidorov等人，1999)，但是后一作物保持不育。即使再生可能从绿叶经由器官发生实现，转化非茄科作物仍然是一挑战。例如，拟南芥属(Arabidopsis)转基因植物是不育的(Sidkar等人，1998),而在油菜作物中甚至稳定的整合和同质性都不能实现(Bing Kai Hou等人,2003)。表I显示在叶绿体中表达转基因的发展例表。表I :叶绿体中的转基因表达权利要求1.适于转化非緑色植物细胞的质体转化载体，所述质体载体包含可操作连接的成分第一侧翼序列、编码外源基因的DNA序列和第二侧翼序列，其中所述侧翼序列来自与所述植物细胞相同的物种，其中所述质体为前质体或叶绿体。2.权利要求I的载体，其还包含在亮处和暗处在前质体和叶绿体中具有功能的5’调节序列。3.权利要求2的载体，其中所述调节序列包含启动子并且所述启动子在亮处和暗处在前质体和叶绿体中生效。4.权利要求3的载体，其中所述启动子是Prrn16S rRNA。5.权利要求4的载体，其中所述调节序列包含psbA5’和psbA 3’元件。6.权利要求2的载体，其中所述调节序列还包含能增强编码外源基因的所述DNA序列转录和翻译的5’ UTR07.权利要求2的载体，其中所述调节序列还包含能赋予编码外源基因的所述DNA序列转录稳定性的3’非翻译区(UTR)。8.权利要求2的载体，其中所述调节序列还T7基因105’UTR09.权利要求8的载体，其中所述调节序列还包含T7基因105’UTR/rps163’UTR。10.权利要求I的载体,其中所述第一侧翼序列约4kb。11.权利要求I的载体，其中所述第二侧翼序列约4kb。12.权利要求6的载体，其中所述5’UTR是psbA的5’ UTR013.权利要求7的载体，其中所述3’UTR是psbA的3’ UTR014.权利要求I的载体，其还包含编码选择性标记的DNA序列。15.权利要求14的载体，其中所述选择性标记为非抗生素选择性标记。16.权利要求15的载体，其中所述非抗生素选择性标记是甜菜醛脱氢酶(BADH)。17.权利要求14的载体，其中编码所述选择性标记的所述DNA序列编码抗生素抗性选择性标记。18.权利要求17的载体，其中所述抗生素抗性选择性标记是aadA。19.权利要求17的载体，其中所述抗生素是氨基糖苷。20.权利要求19的载体，其中所述抗生素是卡那霉素。21.通过体细胞胚胎发生转化质体的方法，所述方法包括步骤将权利要求I的载体整合进植物质体的质体基因组中，其中所述质体为前质体或叶绿体。22.使用非緑色外植体实现质体转化的方法，其中通过体细胞胚胎发生再生植物，包括步骤 a)通过用权利要求I的载体转化植物细胞中的植物质体产生转质体基因组植物细胞，所述植物细胞能够通过体细胞胚胎发生再生，所述选择标记基因蛋白提供了植物细胞对选择剂的抗性； b)在所述选择剂存在下在允许所述转质体基因组细胞形成体细胞胚的条件下培养所述转质体基因本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：H·丹尼尔，
申请(专利权)人：中佛罗里达大学，
类型：发明
国别省市：