冬枣黑斑病菌的便携套嵌式PCR试剂盒制造技术

本实用新型专利技术公开了一种冬枣黑斑病菌的便携套嵌式PCR试剂盒，包括盛有反应液的试管和嵌入试管的衬板，其特征在于所述衬板担置在盒体的子口沿上，盒体的后口沿通过折页轴连接上盒盖；在衬板上设有的成行、成列排列的嵌入孔内按规定的编号分别插入盛有PCR缓冲液的试管、盛有dNTPs液的试管、盛有Taq?DAN聚合酶的试管、盛有含有对套嵌式混合引物的试管、盛有含有冬枣黑斑病菌DNA阳性对照液的试管、盛有双蒸水的试管。该冬枣黑斑病菌的便携套嵌式PCR试剂盒，不仅利用了PCR技术检测冬枣病原菌，提高了灵敏度、缩短了检测周期，而且能使器皿有次序排列、防止易损坏、便于携带、使用方便。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本技术涉及一种黑斑病菌的检测装置，属于植物病原菌的检测领域，特别是适用于冬枣黑斑病菌的田间预防及贮藏前冬枣黑斑病菌快速检测的冬枣黑斑病菌的便携套嵌式PCR试剂盒。
技术介绍
冬枣黑斑病是一种真菌病害，在各冬枣产区均有发生，而且有加重的趋势。冬枣黑斑病在坐果前主要侵染叶片，以后从幼果开始就危害果实。感病果实病斑呈黑褐色，圆形，外围有不同颜色的晕圈或无果实皮层或部分果肉稍有凹陷或腐烂，造成产量、品质下降，不能贮存，严重影响果实的商品性，给枣农造成重大经济损失。该病病原菌为互隔交链孢霉(Alternaria alternate (Fr. )Keissler)，病原菌以菌丝在率树牙鳞和皮痕内越冬，可通过伤口和自然孔口侵入，25°C下潜育期7天左右，7月下旬、8月上旬为发病盛期，病害的发生与气候、树龄、枣园种植结构、昆虫危害等因子密切相关。目前，国内对冬枣黑斑病菌检测主要有分离培养检测和症状观测检测，这些检测具有检测时间长、灵敏度低的缺点，同时还要求检测人员具有丰富的实践经验。而发病初期，由于病原菌少、病害症状不明显，更使得以上检测的灵敏度和检出率受到限制，发展一种基因水平检测、灵敏度高、快速、操作简便的方法，是冬枣黑斑病菌检测急需解决的问题。目前，分子检测技术广泛应用于植物病原菌的检测，由于真菌核糖体基因ITS序列在真菌种间的高度变异和种内的稳定性，为真菌的分子检测提供了理想的靶序列。近年来，利用PCR扩增病原菌核糖体ITS基因区段进行病原菌鉴定、检测及病害诊断的技术得到了很大的发展。PCR技术在植物病原检测上的应用较传统检测方法具有明显的优势，该方法快速、灵敏，能做到种级水平的特异鉴定。所述的套嵌式PCR方法检测，是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对PCR引物扩增完整的片段，第一对与普通PCR相似，第二对结合在第一对PCR产物内部，其优点在于，一是由于第二对引物可以第一对引物扩增产物和病原菌DNA为模板，增加扩增效率，提高检测的灵敏度，二是如果第一对引物扩增生了错误片段，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低，提高检测的准确性。通过检索，目前尚未见PCR技术在冬枣病原检测上应用的报导。
技术实现思路
本技术的目的在于提供一种不仅利用PCR技术检测冬枣病原菌，以提高灵敏度、缩短检测周期，而且能使器皿有次序排列、防止易损坏、便于携带、使用方便的冬枣黑斑病菌的便携套嵌式PCR试剂盒。为实现上述目的，本技术采取的技术方案是该冬枣黑斑病菌的便携套嵌式 PCR试剂盒，包括盛有反应液的试管和嵌入试管的衬板，在衬板上设有成行、成列排列的嵌入孔，其特征在于所述衬板担置在盒体的子口沿上，盒体的后口沿通过折页轴连接上盒盖，在盒盖设有盖锁；在衬板上设有的成行、成列排列的嵌入孔内按规定的编号分别插入盛有PCR缓冲液的试管、盛有dNTPs液的试管、盛有Taq DAN聚合酶的试管、盛有含有对套嵌式混合引物的试管、盛有含有冬枣黑斑病菌DNA阳性对照液的试管、盛有双蒸水的试管。所述的盛有含有对套嵌式混合引物的试管内的混合引物，为用于检测冬枣黑斑病菌的特异性引物，为SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2以及SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4两对套嵌式引物。所述的SEQ ID No. I为5’ -aaatatgaaggcgggctgg-3’，为第一对引物其上游引物核苷酸序列；所述的SEQ ID No. 2为5’ -gagagtgcgacttgtgctg-3’，为第一对引物其下游引物核苷酸序列；所述的SEQ ID No. 3 为 5’-tggaacctctcggggttaca_3’，为第二对引物其上游引物 核苷酸序列；所述的SEQ ID No. 4 为 5’-ctgcgctccgaaaccagtag-3’，为第二对引物其下游引物核苷酸序列。在衬板的一侧还设有备用试管的插入孔；所述的盒盖内设有胶垫层；在衬板的边 沿处设有试管编号标记。本技术的有益效果是不仅利用了 PCR技术检测冬枣病原菌，提高了灵敏度、缩短了检测周期，而且能使器皿有次序排列、防止易损坏、便于携带、使用方便。可广泛用于冬枣黑斑病菌的快速检测。附图说明图I为本技术的结构主视示意图。图2为本技术的衬板俯视示意图。图中1、盒体；2、衬板；3、嵌入孔；4、折页轴；5、盒盖；6、盖锁；7、盛有PCR缓冲液的试管；8、盛有dNTPs液的试管；9、盛有Taq DAN聚合酶的试管；10、盛有含有对套嵌式混合引物的试管；11、盛有含有冬枣黑斑病菌DNA阳性对照液的试管；12、盛有双蒸水的试管；13、备用试管；14、胶垫层。具体实施方式参照图I、图2制作本技术。该冬枣黑斑病菌的便携套嵌式PCR试剂盒，包括盛有反应液的试管和嵌入试管的衬板2，在衬板2上设有成行、成列排列的嵌入孔3，其特征在于所述衬板2担置在盒体I的子口沿上，盒体I的后口沿通过折页轴4连接上盒盖5，在盒盖5设有盖锁6 ;在衬板2上设有的成行、成列排列的嵌入孔3内按规定的编号分别插入盛有PCR缓冲液的试管7、盛有dNTPs液的试管8、盛有Taq DAN聚合酶的试管9、盛有含有对套嵌式混合引物的试管10、盛有含有冬枣黑斑病菌DNA阳性对照液的试管11、盛有双蒸水的试管12。这样，将配置的所有反应液和对照液置于一个盒内，可便于携带，使用方便。使用本技术时，对冬枣叶片、果实等进行简单快速的处理，以获得的DNA为PCR扩增模板，用两对嵌套式引物对模板DNA进行扩增，可在10小时内完成整个PCR检测，不但极大地提高了检测灵敏度，而且缩短了检测时间，结果准确、可靠，是一种行之有效的植物病原菌分子生物学检测方法。所述的盛有含有对套嵌式混合引物的试管10内的混合引物，为用于检测冬枣黑斑病菌的特异性引物，为SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2以及SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4两对套嵌式引物。所述的SEQ ID No. I为5’ -aaatatgaaggcgggctgg-3’，为第一对引物其上游引物核苷酸序列；所述的SEQ ID No. 2为5’ -gagagtgcgacttgtgctg-3’，为第一对引物其下游引物核苷酸序列；所述的SEQ ID No. 3 为 5’-tggaacctctcggggttaca_3’，为第二对引物其上游引物核苷酸序列；所述的SEQ ID No. 4 为 5’-ctgcgctccgaaaccagtag_3’，为第二对引物其下游引物核苷酸序列。 在衬板2的一侧还设有备用试管13的插入孔；所述的盒盖5内设有胶垫层14 ;在衬板2的边沿处设有试管编号标记。其检测过程是提取待测样品DNA作为模板，进行PCR扩增，其中，PCR扩增程序为95°C变性5分钟，95°C变性I分钟；60°C退火30秒；72°C延伸I分钟；35个循环，最后72°C延伸10分钟；然后检测扩增产物取扩增产物，在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压按长度5V/cm电泳30至40分钟，之后在紫外光下检测，如果出现分子量约为400bp的DNA条带，则为阳性对照或待测样品中含有冬枣黑斑病菌。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.冬枣黑斑病菌的便携套嵌式PCR试剂盒，包括盛有反应液的试管和嵌入试管的衬板(2)，在衬板(2)上设有成行、成列排列的嵌入孔(3)，其特征在于所述衬板(2)担置在盒体⑴的子口沿上，盒体⑴的后口沿通过折页轴⑷连接上盒盖(5)，在盒盖(5)设有盖锁(6);在衬板(2)上设有的成行、成列排列的嵌入孔(3)内按规定的编号分别插入盛有PCR缓冲液的试管(7...

【专利技术属性】
技术研发人员：李明，于明礼，张柱岐，
申请(专利权)人：滨州职业学院，
类型：实用新型
国别省市：