本发明专利技术提供一种泽泻致肾毒性作用毒效部位及其制备方法、确认毒效部位的试验方法，所要解决的问题是对泽泻致肾毒性作用的物质基础及部位不甚明确，成为中药现代化、国际化，可持续发展的瓶颈。本发明专利技术的要点是：泽泻致肾毒性作用毒效部位是泽泻水煎液的氯仿萃取物。其制备方法是：制备泽泻水煎液提取物；制备氯仿萃取物。致肾毒性作用的试验方法是采用病理切片和代谢组学的方法。本发明专利技术的用途是，在确定了泽泻致肾毒性作用毒效部位是泽泻水煎液的氯仿萃取物，可为泽泻临床的安全应用提供依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医药领域，具体涉及。
技术介绍
泽湾为泽湾科植物泽湾oriental is (Sam. ) Juzep.的干燥块莖。首载于《神农本草经》，为临床常用药，历版《中国药典》均有收载。仅现行版药典中收载含有泽泻的中成药就有麦味地黄丸、七味都气丸、三宝胶囊、山菊降压片、五苓散、六味地黄丸、血脂灵片等20余种；除作为利水渗湿性中药，还被用作药膳、减肥保健品中，这使得它们得以被长期服用。但一直以来，人们只关注它的治疗功效，却忽略了其长期使用或过量使用后对肾脏造成的毒性作用。中药的毒性研究受限于科技发展水平和科研思路，古代中医学基于临床实践对中药毒性的描述多为笼统的和感性的，如大、中、小毒和上、中、下品(《神农本草经》)；而现代中药毒性研究的思路则长期以来一直參照化学药品毒性评价方法，研究手段主要集中在急性、亚急性和慢性毒性实验上，指标的选择以观察器官组织形态学的改变和某些生化指标的检测为主。这虽然为我们掲示了毒性的症状与程度，但对于现象和特征的描述无法达到从整体观点阐明由毒性所引起的内源性物质基础的变化规律，进而掲示中毒机理的目的。作为众多组学中的ー种，代谢组学是通过考察生物体系受刺激或扰动后其代谢产物的变化来研究生物体系的ー门学科。代谢组学将研究对象作为ー个整体来研究的观点与中医药学整体观思维方式不谋而合，应用代谢组学的全面性系统策略来掲示中药毒性的规律，将有力地推动中医药的现代化进程。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供了、确认毒效部位的实验方法。本专利技术所用的泽泻来自辽宁省医学材料有限公司。本专利技术的技术方案是 I、泽泻致肾毒性作用毒效部位是泽泻水煎液的氯仿萃取物。2、泽泻水煎液的氯仿萃取物的制备方法是首先将泽泻加入其重量8 12倍量的水，室温冷浸过夜，加热煮沸f 3次，每次提取O. 5^2 h，过滤，合并滤液，减压浓缩得到泽泻水煎液提取物；其次，将浓缩后水煎液提取物，用氯仿等体积萃取2 4次，合并萃取液，经旋转蒸发仪50°C，蒸干溶剂，得到氯仿萃取物。3、泽泻水煎液的氯仿萃取物的毒效确认方法 (I)病理切片法取得到的氯仿萃取物，加水稀释至相当于药材浓度2 g/mL，作为氯仿萃取物供试液；取关木通粉碎，加入4倍蒸馏水，浸泡30 min后，加热至沸腾，煎煮60 min，倾出药液，过滤，反复煎煮2次，合并药液，过滤，浓缩至相当于药材浓度O. 5 g/ml作为阳性对照溶液；按体重随机将动物平均分为3组正常对照组，泽泻氯仿萃取物组和关木通阳性对照组，将大鼠放入代谢笼适应7天后每天灌胃一次，连续灌胃120天；于给药120天后将大鼠处死，肾脏称重，并取大鼠的肾组织用10%甲醛固定，石蜡包埋并作薄切片，制成3 ym切片,经苏木精-依红染色，在光学显微镜下观察形态学变化。(2)代谢组学方法取得到的氯仿萃取物，加水稀释至相当于药材浓度2 g/mL，作为氯仿萃取物供试液；取关木通粉碎，加入4倍蒸馏水，浸泡30 min后，加热至沸腾，煎煮60 min，倾出药液，过滤，反复煎煮2次，合并药液，过滤，浓缩至相当于药材浓度O. 5 g/ml作为阳性对照溶液；按体重随机将动物平均分为3组正常对照组，泽泻氯仿萃取物组和关木通阳性对照组，将大鼠放入代谢笼适应7天后每天灌胃一次，连续灌胃120天； ①生物样品的采集 尿液收集采用代谢笼法，于给药120天收集24 h尿液至离心管中，尿样13000 rpm离心3 min后，取上清液置于-20で冰箱中保存备用； 血清收集于给药120天眼眶采血，置于试管中，放置30分钟，取出血饼，溶液13000rpm离心5 min,分离得到血清置于-20で冰箱中保存备用； ②代谢组学生物样品的预处理 尿样预处理取尿样200 yL，置于1.5 mL EP管中，加入200 μ L甲醇，涡旋3min, 13000 rpm条件下离心5 min,取上清液5 μ L进行UPLC-MS分析； 血清样品预处理取200 PL血清加入I. 5 mL EP管中，加入400 PLこ腈沉淀蛋白，在4で的低温环境中，15000 rpm离心10 min，上清液转移至另ーEP管中，保持30で恒温，在队气流下吹干,用100 こ腈-水(15 : 85, v/v)复溶,超声3 min,润旋I min, 13000rpm离心5 min后,取上清液5 μ L进行UPLC-MS分析； ③UPLC-MS分析方法的建立 色谱条件色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18柱6 ;柱温35 °C ;流动相0. 1%甲酸こ腈(A)-O. 1%甲酸水(B)，梯度洗脱； 质谱条件离子源ESI正离子全扫描模式，毛细管电压3.2 kV，锥孔电压30 V，离子源温度120で，脱溶剂温度350で，脱溶剂气N2和锥孔气N2流速分别设置为600和50 L/h。采用全扫面扫描方式，扫描范围为100 900 amu，在运用提取离子多级质谱扫描时，氩气作为碰撞气。NaCsI被用来在实验前作为质量校正； UPLC-MS分析方法的确证尿样和血样分析方法的精密度和稳定性考察均符合要求； ④数据处理 运用Markerlynx软件进行色谱峰识别以及峰匹配，并采用主成分分析法(PCA)对各组大鼠血浆和尿样的代谢物组进行分析。下面结合附图具体说明本专利技术。附图说明图I是实施例九-3中大鼠灌胃给予泽泻氯仿萃取物120天后肾脏组织病理学切片图，其中， (a)是正常空白对照组肾小球的病理学切片图。肾小球显示出明显的正常结构。(b)是正常空白对照组肾小管的病理学切片图。肾小管显示出明显的正常结构。(c)是泽泻氯仿萃取物组肾小球的病理学切片图。肾小球萎缩呈分叶状，肾小囊腔扩张，毛细血管偶见，并见多囊红血球。(d)-(f)是泽泻氯仿萃取物组肾小管的病理学切片图。肾小管内可见少量蛋白渗出，并可见少量炎性细胞。肾小管上皮细胞肿大，管腔縮小，出现粉染无结构的蛋白管型。(g)是阳性对照关木通组肾小球的病理学切片图。肾小球相对于空白对照组未见明显病变。(h)-(i)是阳性对照组关木通组肾小管的病理学切片图。肾小管出现蛋白管型，肾小管上皮细胞肿大，管腔縮小。图2是实施例九-4中大鼠灌胃给予泽泻氯仿萃取物120天后尿样色谱图，以BPI(base peak intensity)图的形式给出。统计学分析结果表明模型组与空白对照组能明显区分。 图3是实施例九-4中大鼠灌胃给予泽泻氯仿萃取物120天后典型的血样色谱图，以BPI (base peak intensity)图的形式给出。统计学分析结果表明模型组与空白对照组能明显区分。具体实施例方式一、泽泻8倍水加入量的水煎液的氯仿萃取物的制备方法是 首先将泽泻加入其重量8倍量的水，室温冷浸过夜，加热煮沸2次，每次提取I h，过滤，合并滤液，减压浓缩得到泽泻水煎液提取物；其次，将浓缩后水煎液提取物，用氯仿等体积萃取3次，合并萃取液，经旋转蒸发仪50°C，蒸干溶剂，得到氯仿萃取物。ニ、泽泻12倍水加入量的水煎液的氯仿萃取物的制备方法是 首先将泽泻加入其重量12倍量的水，室温冷浸过夜，加热煮沸2次，每次提取I h，过滤，合并滤液，减压浓缩得到泽泻水煎液提取物；其次，将浓缩后水煎液提取物，用氯仿等体积萃取3次，合并萃取液，经旋转本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.泽泻致肾毒性作用毒效部位是泽泻水煎液的氯仿萃取物。2.制备权利要求I所述的泽泻水煎液的氯仿萃取物的方法，其特征是首先将泽泻加入其重量8 12倍量的水，室温冷浸过夜，加热煮沸f 3次，每次提取O. 5^2 h，过滤，合并滤液，减压浓缩得到泽泻水煎液提取物；其次，将浓缩后水煎液提取物，用氯仿等体积萃取2^4次，合并萃取液，经旋转蒸发仪50で，蒸干溶剂，得到氯仿萃取物。3.如权利要求2所述制备方法，其特征在于水的加入量为泽泻重量的10倍。4.如权利要求2所述制备方法，其特征在于加热煮沸次数为2次。5.如权利要求2所述制备方法，其特征在于提取时间为lh。6.如权利要求2所述制备方法，其特征在于萃取次数为3次。7.确认权利要求I所述的泽泻致肾毒性作用毒效部位是泽泻水煎液的氯仿萃取物的试验方法，其特征是采用病理切片的方法，具体是 (O制备权利要求I所述的泽泻水煎液的氯仿萃取物； (2)供试液的制备 取得到的氯仿萃取物，加水稀释至相当于药材浓度2 g/mL，作为氯仿萃取物供试液； 取关木通粉碎，加入4倍蒸馏水，浸泡30 min后，加热至沸腾，煎煮60 min，倾出药液，过滤，反复煎煮2次，合并药液，过滤，浓缩至相当于药材浓度O. 5 g/ml作为阳性对照溶液； (3)动物分组及给药方法 按体重随机将动物平均分为3组正常对照组，泽泻氯仿萃取物组和关木通阳性对照组，将大鼠放入代谢笼适应7天后每天灌胃一次，连续灌胃120天； (4)病理切片 于给药120天后将大鼠处死，肾脏称重，并取大鼠的肾组织用10%甲醛固定，石蜡包埋并作薄切片，制成3 ym切片，经苏木精-依红染色，在光学显微镜下观察形态学变化。8.确认权利要求I所述的泽泻致肾毒性作用毒效部位是泽泻水煎液的氯仿萃取物的试验方法，其特征是采用代谢组学的方法的方法，具体是 (O制备权利要求I所述的泽泻水煎液的氯仿萃取物； (2)供试液的制备 取得到的氯仿萃取物，加水稀释至相当于药材浓度2 g/mL，作为氯仿萃取物供试液； 取关木通粉碎，加入4倍蒸馏水，浸泡30 min后，加热至沸腾，煎煮60 min，倾出药液，过滤，反复煎煮2次，合并药液，过滤，浓缩至相当于药材浓度O...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈晓辉，毕开顺，王延年，于治国，马超，俞悦，赵旭，
申请(专利权)人：沈阳药科大学，
类型：发明
国别省市：
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