一种简易、快速分离好氧反硝化芽孢杆菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种分离好氧反硝化芽孢杆菌的方法，对目标物取样进行间歇增氧选择性富集培养，然后对富集培养物进行水浴后，稀释涂布梯度NO2--N/NO3—N平板，以利用NO2--N/NO3—N与相应的显色剂显色的特点，从喷涂显色液后的平板中高NO2--N/NO3—N浓度区域选取菌落周边无显色或显色浅淡菌落，快速筛出好氧反硝化菌；通过划线法得到纯培养菌株，接着对纯培养物进行染色镜检，以初筛选出具有好氧反硝化能力的芽孢杆菌；最后根据纯菌株在不同NO2--N/NO3—N浓度的富集培养基的生长情况以确定适宜的NO2--N/NO3—N浓度，设计好氧反硝化降解试验复筛出高效好氧反硝化能力的菌株。本发明专利技术方法具有快速分离、提纯出高效好氧反硝化的芽孢杆菌的特点，为生物脱氮技术提供了一个新的途径。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物脱氮领域，具体涉及。
技术介绍
好氧反硝化是指有氧气的条件下发生的反硝化现象，近些年来不断有好氧反硝化菌被分离出来(已报道的菌属有如副球菌属、假单孢菌属、产碱菌属、芽孢杆菌属等50多个菌属存在好氧反硝化现象)，这就为生物脱氮技术提供了一个新的途径。好氧反硝化与传统的反硝化相比具有如下优点1、在有氧条件下进行反硝化，硝化作用和反硝化作用可同时在一个反应器中进行，设备与操作成本大幅下降；2、硝化作用的产物可直接作为反硝化作用的底物，避免抑制硝化作用，硝化和反硝化进程加快，缩短了脱氮周期。所以，好氧反硝化脱氮技术是当前与以后一段时间内的科学研究的热点。芽孢杆菌属的特点1.细菌呈直杆状，细胞染色大多数在幼龄培养时呈G+，好氧或兼性厌氧，化能异氧菌， 具有发酵或呼吸代谢类型；在条件不利的情况下形成芽孢，将自已保护起来，复活率高。其有耐酸、耐盐、耐高温及耐挤压等，故以其开发产品有较高的稳定性2.菌体生长营养要求简单。3.有较强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性，对污染水体的有机物有较强的降解能力。综上所述，设计出，以利于快速分离、 提纯出高效好氧反硝化的芽孢杆菌，以期为生物脱氮作贡献。好氧反硝化菌的分离方法有很多，主要有选择性富集法；稀释法；间歇曝气法。
技术实现思路
本专利技术提供了，筛选出具有反硝化水体(水产养殖、与环境污染水体)中硝态氮与亚硝态氮的芽孢杆菌。为实现上述目的本专利技术采用如下技术方案一种简易、快速分离筛选好氧反硝化芽孢杆菌的方法，其特征在于选择如土壤、池塘水样、泥样或活性污泥等目标物接种于含有N02_-N/N03—N的富集培养基中，进行间歇增氧富集培养；移取适量富集培养物75-80°C水浴杀除杂菌，稀释后涂布于含N02_-N/N03一N梯度平板培养；然后对培养后的平板进行喷涂N02_-N/N03一N显色液，挑取菌落周边无显色或显色浅淡菌落，继续用划线法获得纯培养物，对纯培养物革兰氏染色镜检，以内生芽孢杆菌的作为初筛菌株；接着利用纯培养物菌体在不同N02_-N/N03一N浓度的培养基中，恒温间歇增氧培养，测定其0D600nm吸光度值，以定量的确定芽孢杆菌所适应的N02__N/N03一N浓度范围；在确定的适中的N02_-N/N03一N浓度下，用含有N02__N/N03一N的液体富集培养基，分别培养不同好氧反硝化芽孢杆菌，通过测定液体富集培养基中N02_-N/N03一N含量，以求解其去除率，复筛出好氧反硝氧能力强劲的芽孢杆菌。所述的简易、快速分离好氧反硝化芽孢杆菌的方法，其特征在于所述的富集培养基用的是LB培养基2. 0-200. O mg/lN02_-N/N03—N ;所述的LB培养基(g/Ι):胰蛋白胨10.0，氯化钠 5.0，酵母膏 10，水 1000ml, PH 7. 2，121°C，灭菌 25_30min。本专利技术的有益效果目前现有技术在分离反硝化细菌多用BTB培养基，利用反硝化过程中碱的特性，利用培养基中BTB (溴百里酚蓝)指示剂在PH值> 7. 6显示蓝色，来间接判断有反硝化细菌的有无。其培养基组份较复杂，且营养不全面，富集培养时间长，无针对性快速分离好氧反硝化芽孢菌缺点；利用本专利技术的方法，具有培养基组成简单(一般的化验室条件均有条件)，营养全面，且有促生长因子故富集培养时间短，用针对性的显色剂喷涂，更直观。初筛中加入水浴环节能有效提高芽孢菌的检出率，大大降低在筛选目标菌株的工作量。应用定性与定量的方法相给合，使得工作效率更快。总之，本专利技术方法具有简易、快速、直观、高效分离具有好氧反硝化能力芽孢杆菌的的特点，为生物脱氮技术提供了一个新的途径。具体实施例方式下面通过具体实施例来进一步说明。实施例仅用于本专利技术而不用于限制本专利技术的范围；此外应理解为在阅读本专利技术所叙述之后，本领域的技术人员可能对本专利技术作各种改动与修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限制的范围。实施例I 一种简易、快速分离筛选好氧反硝化芽孢杆菌的方法，具体操作如下 选择如土壤、池塘水样、泥样或活性污泥等目标物接种于含有N02_-N/N03一N的富集培养基中，进行间歇增氧富集培养；移取适量富集培养物75-80°C水浴杀除杂菌后，稀释涂布于含N02—-N/N03一N梯度平板培养；然后对培养后的平板进行喷涂N02—-N/N03一N显色液，挑取菌落周边无显色或显色浅淡菌落，继续用划线法获得纯培养物，对纯培养物革兰氏染色镜检，以内生芽孢杆菌的作为初筛菌株；接着利用纯培养物菌体在不同N02_-N/N03一N浓度的培养基中，恒温间歇增氧培养，测定其0D600nm吸光度值，以定量的确定芽孢杆菌所适应的N02--N/N03一N浓度范围；在确定的适中的N02--N/N03一N浓度下，用含有N02--N/N03一N的液体富集培养基，分别培养不同好氧反硝化芽孢杆菌，通过测定液体富集培养基中N02—-N/ N03—N含量，以求解其去除率，复筛出好氧反硝氧能力强劲的芽孢杆菌。所述的富集培养基用的是LB培养基+2. 0-200. O mg/lN02_-N/N03一N ;所述的LB培养基(g/Ι):胰蛋白胨 10. 0，氯化钠 5. O,酵母膏 10，水 1000ml, PH 7. 2，121°C，灭菌 25_30min。制作N02—-N/N03一N梯度平板取IOml LB琼脂培养基于直径9cm的培养皿中，立即将培养皿斜放，使高处的培养基正好位于皿边与皿底的交接处。等凝固后，再将平皿平放，再加入含有一定浓度的N02—-N/N03一N的LB琼脂培养基10 ml.凝固后，便得到N02—-N/ N03一N从设定浓度到O逐渐递减的浓度梯度的培养皿。上层培养基越厚，N02—-N/N03一N的浓度越高(也可在培养皿底部用“一”作N02—-N/N03一N浓度递增标识)。N02—-N/N03一N取值2.0-200. O mg/1，所述的LB琼脂培养基在LB培养基的基础上加入I. 5-2. 0%琼脂粉或琼脂条，121°C，灭菌 25-30min。在制作好的梯度平板上涂布培养目标物14-48hr后，喷涂N02:N/N03一N显色液， 挑取菌落周边无显色或显色浅淡菌落，继续用划线法获得纯培养物，对纯培养物革兰氏染色镜检，以内生芽孢杆菌的作为初筛菌株。根据目标菌株所在梯度平板中所在的位置与数量，便可大致知道该菌株的N02\N/N03一N的耐受范围。所述的N02二N/ N03-N显色液为N02一- N显色液(格里斯氏试剂)配制A液对氨基苯磺酸O. 5 g,稀醋酸(10%左右)150ml B液a-萘胺O. I g,蒸馏水20 ml,稀醋酸(10%左右)150ml 临用前将A、B液混合。所述的N03一- N显色液(二苯胺试剂)配制取二苯胺O. 5 g溶于IOOml浓硫酸中,用20ml蒸懼水稀释。所述的革兰氏染色法所用试剂结晶紫染色液A液结晶紫2. Og, 95%乙醇20ml,B液草酸铵O. 8g,蒸懼水80ml,混合A、B液，静置48h后过滤使用，碘液碘I. 0g，碘化钾2. 0g，蒸馏水300ml。先用少量(3_5 ml)蒸馏水溶解碘化钾，再加入碘片，待碘片溶解后，加水稀释到300ml。脱色液95%乙醇。O. 5%番红复染液取2. 5%番红乙醇液20ml，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：朱杰，吴文坤，周呈祥，
申请(专利权)人：安徽联大生物环保科技有限公司，
类型：发明
国别省市：