一种眼斑拟石首鱼的抗虫肽及其基因克隆方法和应用技术

一种眼斑拟石首鱼的抗虫肽及其基因克隆方法和应用，涉及一种海洋动物抗虫肽及基因克隆方法。眼斑拟石首鱼的抗虫肽piscidin的cDNA全长序列的核苷酸序列为序列1；眼斑拟石首鱼抗虫肽piscidin的氨基酸序列为序列2。眼斑拟石首鱼piscidin的cDNA全长序列的克隆方法：利用刺激隐核虫感染眼斑拟石首鱼，诱导并提高抗虫肽的表达水平；利用感染后鳃部出现明显“白点”的眼斑拟石首鱼的头肾提取总RNA，反转录成cDNA作为PCR模板；参考鱼类piscidin的cDNA序列设计同源引物，利用RT-PCR和RACE等技术，克隆眼斑拟石首鱼piscidin的cDNA全长序列。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种海洋动物抗虫肽及基因克隆方法，尤其是涉及一种眼斑拟石首鱼的抗虫肽piscidin及其基因克隆方法和应用。
技术介绍
刺激隐核虫是目前严重威胁海洋鱼类的一种传播性极强的寄生虫，已被列为农业部2008年12月11日发布的新版《一、二、三类动物疫病病种名录》(农博，2009。农业部发布《一、二、三类动物疫病病种名录》，渔业致富指南6 :6)中的二类动物疫病，它所引发的“白点病”和继发性细菌性感染给我国海水鱼类养殖带来了巨大的损失。尤其以大黄鱼 (Pseudosciaena crocea)、石斑鱼(Epinephelussp.)、卵形鲳錄(Trachinotus ovatus)等 “白点病”危害最为严重，每年都带来了数亿元的经济损失，寄生虫的防治是目前鱼类养殖急需解决的重大难题。目前，防治海水鱼类“白点病”的方法十分有限，化学杀虫药物的长期使用可使海洋污染加剧和海洋鱼类健康严重受损，这已成为“白点病”问题年趋恶化的重要因素之一， 探索健康安全的新型防控方式是水产业迫切需要的产业技术需求。海洋动物自身存在着宿主防御肽(Host Defense Peptide, HDP)以应对鱼类自身面临的疾病威胁，其中海洋动物自身的抗虫活性物质为解决海水养殖鱼类自身的寄生虫难题提供了重要启示。2008年，国外首次报道杂交斑纹S卢(hybrid striped bass)的抗菌肽 piscidin(源自英文单词Piscine,意为鱼的)具有较强的抗外寄生虫的作用。我国也发现蓝子鱼(Siganus ConcatenaluJ)的血清(王方华，2010。黄斑蓝子鱼血清抗寄生虫及细菌活性物质的研究，中山大学博士学位论文)中存在着抗虫活性物质。从丰富的海洋动物抗虫活性物质资源库中筛选具有特殊杀虫效果的抗虫肽，进行抗虫相关产品开发或者提高鱼类自身抗虫水平，具有巨大的科学价值、市场需求和发展前景。鱼类piscidin是一类非常重要的抗菌肽，对细菌、真菌、寄生虫同时具有抗性，因此，它作为重要的抗虫肽资源，对于解决刺激隐核虫重大产业技术难题具有潜在价值和重要意义。在利用基因工程技术制备生产过程中，抗虫肽piscidin是否具有外源基因毒性， 是决定能否低成本生产制备的技术关键之一。因为毒性基因可能对工程菌株(大肠杆菌或酵母菌)自身造成毒性，使产率偏低，成本大幅上升。我国尚未有海洋动物抗虫肽的相关公开报道。
技术实现思路
本专利技术的第一目的是针对现有存在的严重危害海洋鱼类的刺激隐核虫病，提供既能有效杀灭刺激隐核虫，对环境不会造成不良影响，又能容易借助基因工程技术生产制备抗虫肽产品的眼斑拟石首鱼的抗虫肽piscidin的cDNA全长序列的核苷酸序列。本专利技术的第二目的在于提供眼斑拟石首鱼抗虫肽piscidin的氨基酸序列。本专利技术的第三目的在于提供眼斑拟石首鱼piscidin的cDNA全长序列的克隆方本专利技术的第四目的在于提供眼斑拟石首鱼抗虫肽piscidin在制备防治刺激隐核虫病药物中的应用。所述眼斑拟石首鱼的抗虫肽piscidin的cDNA全长序列，其核苷酸序列记为序列 I，所述序列I为ttctcttactgagaatacagtctacagtctacagactatccatcagtgaaaggatgaagt60gtactgcggtctttcttgtgttgttcatggtcgttctcatggctgaacctggagagtgta120tctggggactgatcgcccatggagtcgcgcatgttggttcgttgatccatgggcttgtca180atgggaaccatggcgggaaccaggcggaggagcagcaggagcagctcaacaaacgttcac240tttcttatgaccacccgtaggagcttcaacggcgagactgaagatgaagcaacgtcagaa300agaaacgtgtctatgaactggtggaaacacttcttgaaaatatatatacgatttcaagtc360agttgttcagaataaatttggatctcagcaC C420 423 所述眼斑拟石首鱼抗虫肽piscidin的氨基酸序列记为序列2，所述序列2为MetLysCysThrAlaValPheLeuValLeuPheMetValValLeuMet-20-15-10AlaGluProGlyGluCysHeTrpGlyLeuHeAlaHisGlyValAla-5-II510HisValGlySerLeuHeHisGlyLeuValAsnGlyAsnHisGlyGly152025AsnGlnAlaGluGluGlnGlnGluGlnLeuAsnLysArgSerLeuSer303540TyrAspHisPro所述眼斑拟石首鱼抗虫肽piscidin的氨基酸序列是根据所述眼斑拟石首鱼的抗虫肽piscidin的cDNA全长序列推导获得的。所述氨基酸序列组成的多肽包含信号肽、成熟肽和优势域三个部分。眼斑拟石首鱼piscidin的成熟肽序列，即抗虫肽(功能肽)，是编码22个氨基酸， 具有两亲性α螺旋结构，含有丰富的碱性氨基酸。具体的序列命名为So-Piscidin :Ile Thr Gly Leu He Ala His Gly Val Ala His Val Gly Ser Leu He His Gly Leu Val Asn Gly0所述眼斑拟石首鱼piscidin的cDNA全长序列的克隆方法包括以下步骤I)利用刺激隐核虫感染眼斑拟石首鱼，诱导并提高抗虫肽piscidin的表达水平；2)利用感染后鳃部出现明显“白点”的眼斑拟石首鱼的头肾提取总RNA，然后反转录成cDNA作为PCR模板，此模板能有效扩增出抗虫肽的cDNA或片段；3)参考鱼类piscidin的cDNA序列设计同源引物，利用RT-PCR和RACE等技术，克隆眼斑拟石首鱼piscidin的cDNA全长序列。所述抗虫肽的多肽产物具有杀灭刺激隐核虫的作用，具有较弱的杀菌活性，能应用于制备防治刺激隐核虫病的药物。本专利技术所提供的抗虫肽基因的多肽产物(成熟肽)能有效杀灭刺激隐核虫，仅具有较弱的抗菌作用，多肽产物的制备方法、杀虫活性及抗菌作用如下(I)固相化学合成法制备抗虫肽So-piscidin利用美国应用生物系统公司(AppliedBiosystems)生产的Pioneer多肽合成仪制备So-Piscidin,以便进行抗菌活性与抗虫特性的研究。人工合成抗虫肽So-Piscidin的固相化学法包括以下步骤固相化学法合成、剪切、纯化和质谱分析等步骤，具体方法见实施例3。(2)所制备抗虫肽So-Piscidin能够有效杀灭刺激隐核虫从受刺激隐核虫感染的卵形鲳鰺中收集寄生虫包囊，孵化出的感染幼虫用于杀虫实验。开展所制备抗虫肽So-Piscidin杀灭刺激隐核虫的时间效应与剂量效应实验,观察实验过程中感染幼虫死亡率及死亡过程的形态学变化，具体方法见实施例4。(3)所制备抗虫肽So-Piscidin仅具有较弱的抗菌活性将本专利技术所制备的抗虫肽按O. 5mg/管分装冷冻保存用于抗菌活性测定。抗菌活性测定采用微量肉汤稀释法，以金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性菌和大肠杆菌、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：毛勇，王军，金媛，牛素芳，邬阳，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：