具有提高的L-缬氨酸生产能力的微生物及利用该微生物生产L-缬氨酸的方法技术

本发明专利技术涉及具有提高的L-缬氨酸生产能力的微生物及利用该微生物生产L-缬氨酸的方法。更具体地，本发明专利技术涉及耐L-缬氨酸及其衍生物，从而具有提高的L-缬氨酸生产能力的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium?glutamicum)突变株，以及利用该微生物生产L-缬氨酸的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及具有提高的L-缬氨酸生产能力的微生物及利用该微生物生产L-缬氨酸的方法。
技术介绍
L-氨基酸应用于人类医学中，特别是用于制药工业、食品工业和动物营养等。具体而言，支链氨基酸是指九种必需氨基酸中的三种氨基酸L-缬氨酸、L-亮氨酸、 L-异亮氨酸。不同于主要在肝脏中代谢的其它氨基酸，支链氨基酸主要在肌肉组织中代谢， 并作为运动时的能量来源。由于已知支链氨基酸在运动过程中对肌肉的维护和生长发挥了重要作用，它们的用途也越来越多。具体来说，L-缬氨酸被用作饲料成分，因为据报道， L-缬氨酸可高效降低功耗并且有助于改善母猪的泌乳性能。L-缬氨酸也被用于医疗目的的输液和氨基酸复合物，以及用于保健品和饮料添加剂。棒形细菌是用于生产L-氨基酸的代表性微生物，特别是谷氨酸棒杆菌 (Corynebacterium glutamicum)。由于棒形细菌在工业生产中的重要性，利用该微生物生产L-氨基酸的方法在不断地进行改进。例如，正在改善与搅拌和通入氧气有关的方法，或改善在发酵过程中培养基的组成如糖浓度。为了改善这些微生物的L-氨基酸生产能力， 筛选和突变体筛选的方法被广泛使用。例如，有一种筛选和利用耐抗代谢药物的微生物的方法，，所述抗代谢药物为如异亮氨酸衍生物，异亮氨酸羟肟酸(Kisumi M等，(1972)细菌学杂志(Journal of Bacteriology) 110 :761-763)，L-缬氨酸衍生物，2-噻唑丙氨酸 (Tsuchida T 等，(1975)农业和生物化学(Agricultural and Biological Chemistry),日本39 :1319-1322)或亮氨酸衍生物，α -氨基丁酸酯(Ambe-Ono Y等，(1996)生物科学，生物技术与生物化学(Bioscience Biotechnology Biochemistry) 60 :1386-1387)，或为与调节相关的代谢产物的营养缺陷型以及生产L-氨基酸(Eva Radmacher等，(2002)应用和环境微生物学(Applied and Environmental Microbiology)，卷.682M6-2250 页)。同时，支链氨基酸之一的L-缬氨酸，在微生物中从丙酮酸开始经过乙酰乳酸、二羟基异戊酸和酮异戊酸进行生物合成。这些中间代谢产物是通过乙酰羟酸合成酶、乙酰羟酸还原异构酶、二羟酸脱水酶和转氨酶B的催化活性而产生的。然而，这些酶也参与从酮基丁酸和丙酮酸开始的L-异亮氨酸的生物合成，且L-亮氨酸也从中间代谢产物，酮异戊酸经过2-异丙基苹果酸、3-异丙基苹果酸和酮基异己酸生物合成。因此，由于支链氨基酸，即 L-缬氨酸、L-异亮氨酸和L-亮氨酸的生物合成途径中使用的酶是相同的，很难通过工业发酵只生产一种支链氨基酸。此外，由于终产物L-缬氨酸或其衍生物导致反馈抑制的发生， 使得L-缬氨酸的工业化大规模生产变得困难。为解决这些问题，已经进行了许多研究以开发耐L-缬氨酸或其衍生物的生产 L-缬氨酸的微生物，用于生产L-缬氨酸，例举的方法有，使用耐D，L-氨基丁酸的微生物的方法(日本专利公开号S63-160592)，使用耐噻唑丙氨酸以及亮氨酸、异亮氨酸或苏氨酸营养缺陷型的微生物的方法(日本专利公开号S52-116)，使用耐氨乙基半胱氨酸的微生物的方法(日本专利公开号S584678)，使用在补加乙酸的培养基中耐L-缬氨酸且在补加葡萄糖的培养基中对丙酮酸敏感的微生物的方法(美国专利号5，521，074，韩国专利号 1995-0005133)，使用耐聚酮的微生物的方法(韩国专利号1996-0016871)等。然而，目前开发的生产L-缬氨酸的微生物只对L-缬氨酸或其衍生物的单一种类物质或有限物质具有抗性，因此仍然有必要开发对参与L-缬氨酸生物合成的反馈调控的各种物质具有抗性的生产L-缬氨酸的微生物。基于这些原因，本专利技术人已付出许多努力去开发较其它常规菌株高产L-缬氨酸的微生物。结果是，他们发现了从谷氨酸产生菌获得的突变株可高产L-缬氨酸，并对多种 L-异亮氨酸衍生物和L-缬氨酸衍生物，具体为α -氨基丁酸(ΑΒΑ)、α -羟基缬氨酸(AHV)、 噻唑丙氨酸(TA)和正缬氨酸(NV)具有抗性，从而完成了本专利技术。专利技术概述本专利技术的目的是提供生产L-缬氨酸的谷氨酸棒杆菌突变株KCCM11201P。本专利技术的另一目的是提供利用该突变株生产L-缬氨酸的方法。附图说明图1为本专利技术以L-缬氨酸为终产物的生物合成途径。优选实施方案详述在一个实施方案中，本专利技术提供生产L-缬氨酸的谷氨酸棒杆菌突变株 KCCMl120IP。本文中使用的术语“L-缬氨酸”是指化学式为(CH3)2CHCH(NH2) COOH的L-氨基酸， 其为人体必需的氨基酸之一，与L-亮氨酸和L-异亮氨酸一起在结构上属于支链氨基酸。同时，微生物的L-缬氨酸生物合成示于图1，其中L-缬氨酸是从丙酮酸起始经过乙酰乳酸、二羟基异戊酸和酮异戊酸进行生物合成。此外，该生物合成途径是由酶如乙酰羟酸合成酶、乙酰羟酸还原异构酶、二羟酸脱水酶和转氨酶B催化的。然而，这些酶被同样地用于支链氨基酸，即L-缬氨酸、L-异亮氨酸和L-亮氨酸的生物合成途径，因而通过工业发酵很难只生产一种支链氨基酸。尤其是终产物L-缬氨酸或其衍生物导致反馈抑制的发生， 使得很难进行工业化大规模生产L-缬氨酸。为了解决这个问题，本专利技术的突变株是一种耐 L-缬氨酸或其衍生物的新微生物，以消除反馈抑制从而具有提高的L-缬氨酸生产能力。优选地，本专利技术的突变株可对缬氨酸或其衍生物、异亮氨酸或其衍生物具有抗性。本文中使用的术语“衍生物”是指已知的诱导与终产物L-缬氨酸生物合成相关的反馈抑制，从而减少微生物生产L-缬氨酸的产量的化合物，L-异亮氨酸衍生物的实例可以是α-氨基丁酸和L-缬氨酸衍生物，α-羟基缬氨酸、噻唑丙氨酸、正缬氨酸等，但不限于此。优选地，突变株可对选自下组的一种或多种物质具有抗性缬氨酸、α-氨基丁酸、 α-羟基缬氨酸、噻唑丙氨酸和正缬氨酸。更优选地，其可对所有的缬氨酸、α-氨基丁酸、 α -羟基缬氨酸、噻唑丙氨酸和正缬氨酸具有抗性。一般来说，已知当L-缬氨酸在细胞中积累到一定程度时，L-缬氨酸生物合成受到抑制。因此，耐受该衍生物的菌株缓解了 L-缬氨酸的抑制，从而甚至可以高浓度生产。根据本专利技术的一个实施方案，专利技术人采用了一种筛选通过利用该衍生物能够产生高水平L-缬氨酸的微生物的方法。此外，由于L-异亮氨酸是一种其生物合成途径与L-缬氨酸生物合成途径相同的氨基酸，通过分析菌株是否获得了异亮氨酸衍生物抗性，也可筛选出能够产生高水平L-缬氨酸的菌株。因此，异亮氨酸衍生物也可用于筛选能够产生高水平L-缬氨酸的菌株。根据本专利技术，具有提高的L-缬氨酸生产能力的突变株选自进行了突变的亲本菌株。在这方面，微生物突变可采用本领域广泛公知的各种技术来诱导，并可以使用任何一种物理和化学诱变因子。适合本专利技术的化学诱变因子的实例包括N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、二环氧丁烷、乙基甲烷磺酸盐、芥菜类化合物(mustard compounds)、胼和亚硝酸，但不限于此。此外，物理诱变因子的实例可包括紫外线和Y射线，但不限于本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
2011.08.16 KR 10-2011-00811461.生产L-缬氨酸的谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)突变株 KCCMl120IP。2.根据权利要求1所述的突变株KCCM11201P，其中该突变株耐L-缬氨酸、L-异亮氨酸和它们的衍生物。3.根据权利要求2所述的突变株KCCM11201P，其中所述L-异亮...

【专利技术属性】
技术研发人员：金蕙园，李智惠，黄水渊，金宗贤，
申请(专利权)人：CJ第一制糖株式会社，
类型：发明
国别省市：