一种测定甲胎蛋白的电化学免疫传感器的制备方法，尤其是基于金杂化的纳米介孔SiO2复合材料的甲胎蛋白的电化学免疫传感器的制备方法。并采用该免疫传感器建立了甲胎蛋白的测定方法。其特征在于：首先合成纳米介孔SiO2-纳米金复合材料，将辣根过氧化物酶、第二抗体固定到该复合材料上形成了复合物；然后将硫堇-石墨烯复合物用于一抗的固定，从而制备了测定甲胎蛋白的电化学免疫传感器，该免疫传感器成功地用于甲胎蛋白的测定。本发明专利技术的电化学免疫传感器表现出了优良的准确性、高灵敏度性、稳定性与重现性，免疫分析检测迅速、方便，可用于临床分析，为癌症的早期诊断提供了重要的依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，尤其是基于金杂化的纳米介孔SiA复合材料的测定甲胎蛋白的电化学免疫传感器的制备方法。
技术介绍
近年来，纳米材料在单分子水平的各种探针技术、纳米集成阵列器件、电极表面修饰等方面的研究将取得了大范围的进展。其中，将纳米材料引入电极表面，能有效增加电极的比表面积，加快电子的传递，增强电极的导电性，提高生物大分子例如酶的固定量，增强传感器的灵敏度和稳定性，提高传感器的响应速度等。纳米介孔SiO2材料(MSN)具有比表面积大、孔径较大、生物相容性较好等优点，能有效地固定辣根过氧化物酶(HRP)，增强体系的催化活性，是组装免疫传感器的良好材料。金纳米粒子具有比表面积大、表面反应活性高、表面活性中心多、催化效率高、吸附能力强等性能，良好的生物相容性和稳定性，可用于固载和标记生物分子。将MSN和金纳米粒子(Au)通过复盐法合成得到MSN-Au复合材料， 即保留了两者原有的优点，又能进一步提高电子传递效率，增强酶的活性，可用于免疫传感器的制备。甲胎蛋白(a -fetoprotein，AFP)是胚胎发育早期的一种主要血清蛋白，血清中甲胎蛋白的升高对原发性肝癌诊断具有重要的意义。目前甲胎蛋白的检测方法主要有酶联免疫分析法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)、间接血酶法和琼脂双扩散法等。这些方法灵敏、可靠，但酶不稳定，放射性物质设备要求高，且危害较大。近年来有报道采用电化学方法与免疫反应结合检测甲胎蛋白，该法所需设备简单、成本低廉，灵敏度高，检出限低，并且将纳米复合材料引入到电化学免疫传感器，可以增强酶的活性。CN101441218建立了一种利用CdTe量子点和!^e3O4-Dextran纳米颗粒检测血清中的甲胎蛋白含量的方法，其步骤包括Fe3O4-Dextran-第一抗体复合物的制备及CdTe-第二抗体复合物的制备，根据荧光强度大小测定了肝癌病人的甲胎蛋白值。CN101566636A专利技术建立了一种定量检测血液中甲胎蛋白的磁性免疫层析试纸条及其制备方法，该专利技术将磁性免疫层析技术和生物素亲和素系统引入到血液中甲胎蛋白的定量检测中，大大提高了检测灵敏度。本专利技术基于MSN-Au为载体材料，建立了，提高了检测的灵敏度，线性范围宽。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，其特征包括以下步骤(1) (MSN-Au)-HRP-甲胎蛋白第二抗体(Ab2)复合物的制备；(2)硫堇(TH)-石墨烯(GS)混合溶液的制备；(3)建立电化学免疫传感器，测定甲胎蛋白，绘制工作曲线。本专利技术中所述的(MSN-Au)-HRP-Ab2复合物的制备，其特征在于过程具体包括以下步骤(I)MSN-Au纳米复合材料的制备将氨基修饰的MSN和H4AuCl4按照质量1.2 1的比例混合，在室温下，用磁力搅拌器轻轻搅拌，然后加入盐酸调节酸度，然后再搅拌，加入40mmol · L—1的硼氢化钠，直到其颜色变成黑色(紫色、黑色)，离心，室温真空干燥，即可获得MSN-Au纳米复合材料；(2) (MSN-Au) _HRP+Ab2 复合物的制备将1. Omg · ml^MSN-Au纳米复合材料溶液和1. Omg · mL^HRP溶液以及 1. Omg .HiL-1Al32溶液按照1 1. 2 1 0. 5 1. 2的体积比进行混合，轻微摇晃吸附Mh， 离心，将所得的物质再分散于0. 05mol · L-1PH = 7. 50的PBS缓冲溶液中备用。本专利技术中所述的TH-GS混合溶液的制备包括以下步骤将1. Omg · mL^GS溶液和 1. Omg · Hir1TH溶液混合并超声20 30h。本专利技术中所述的建立电化学免疫传感器，测定甲胎蛋白，绘制工作曲线，其特征在于包括以下步骤(1)将5mm直径的玻碳电极依次用1. 0，0. 3和0. 05 μ m的三氧化二铝抛光粉抛光处理，再用超纯水冲洗干净，然后将电极置于0. 05mol -L"1铁氰化钾溶液中，在-0. 6 0. 6V 扫描，峰电流差小于85mA;(2)将3 8 μ L GS+TH溶液滴到玻碳电极表面，待晾干；(3)滴涂3 8 μ L体积分数为3%的戊二醛溶液保持润湿，水清洗，晾干成膜；(4)滴涂3 8 μ L 1. Omg · mL—1甲胎蛋白第一抗体(Abl)至玻碳电极表面，放置一段时间保持润湿，水清洗，晾干；(5)将3 8yL Ig "Γ1牛血清白蛋白溶液滴涂至玻碳电极表面，放置一段时间， 晾干；(6)将不同浓度的甲胎蛋白抗原溶液滴涂到玻碳电极表面，反应一段时间，测定其氧化还原电位变化；(7)将3 8 μ L(MSN-Au)-HRP-Ab2复合物溶液滴涂到含有甲胎蛋白抗原的玻碳电极上，反应0. 5 1. 5h，然后分别在5mL pH = 7. 50PBS缓冲溶液和含有lmmol H2O2的5mL PH = 7. 50PBS缓冲溶液的溶液测定其氧化还原电位变化；(8)根据所得电流差值与甲胎蛋白抗原浓度呈线性关系，绘制工作曲线。本专利技术中石墨烯具有优良的导电性。MSN-Au复合材料具有比表面积大、孔径较大、 生物相容性较好等优点，能够固定更多的HRP，增强体系的催化活性。本专利技术的电化学免疫传感器表现出了优良的准确性、高灵敏度性、稳定性与重现性，免疫分析检测迅速、方便，可用于临床分析。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。实施例1步骤1.将氨基修饰的纳米介孔SW2和H4AuCl4按照质量1. 2 1的比例混合，在室温下，用磁力搅拌器轻轻搅拌，然后加入盐酸调节酸度，然后再搅拌，加入40mmol · L—1的硼氢化钠，直到其颜色变成黑色(紫色、黑色)，离心，室温真空干燥，即可获得MSN-Au纳米复合材料；步骤2.将 1. OmL 1. Omg · ml^MSN-Au 纳米复合材料溶液和 1. OmL 1. Omg · mL^HRP 溶液以及1. OmL 1. Omg ^L4Ab2溶液进行混合，轻微摇晃吸附Mh，离心，将所得的物质再分散于1. OmL 0. 05mol · L^pH = 7. 50的PBS缓冲溶液中备用；步骤3.将5mm直径的玻碳电极依次用1. 0,0. 3和0. 05 μ m的三氧化二铝抛光粉抛光处理，再用二次水冲洗干净，然后将电极置于0. 05mol -L"1铁氰化钾溶液中，在-0. 6 0. 6V扫描，峰电流差为80mA ； 步骤4.将0. 5mL Img · mL^GS溶液和0. 5mL Img · mL^TH溶液混合并超声24h,然后将5 μ L所得GS+TH溶液滴到玻碳电极表面，自然干燥；步骤5.滴涂体积分数为3%的戊二醛溶液大约1. Oh保持润湿，超纯水清洗，晾干成膜；步骤6.滴涂5yL LOmgmr1甲胎蛋白第一抗体至玻碳电极表面，放置一段时间保持润湿，水清洗，晾干；步骤7.将3yL Ig "Γ1牛血清白蛋白溶液滴涂至玻碳电极表面，放置一段时间， 晾干；步骤8.将0. 01 16ng -πιΓ1不同浓度的甲胎蛋白抗原溶液分别滴到不同电极表面，反应1. 0h，测定其氧化还原电位变化；步骤9.将5 μ L(MSN-Au)-HRP-Ab2复合物溶液滴涂到含有甲胎蛋白抗原的玻碳电极上，反应1. 0h，然后本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：魏琴，李贺，韩颜颜，李玉阳，杜斌，吴丹，马洪敏，庞雪辉，罗川南，范大伟，李燕，辛晓东，赵燕芳，蔡燕燕，杨健，崔振涛，毛珂霞，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：
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