本发明专利技术提供一种从虎杖、花生壳、葡萄皮等植物材料中高效提取白藜芦醇苷及其类似物所用的微生物菌株棘孢曲霉（Aspergillus.aculeatusCGMCCNo.3876）及其发酵制备的复合酶；用所述菌株的复合酶酶法提取虎杖苷及其类似物，提取率为2.3%；比未加所述菌株棘孢曲霉的胞外酶（对照）提取虎杖苷及其类似物，处理提高了91.7%。用所述菌株的复合酶转化白藜芦醇苷（虎杖苷）为白藜芦醇的转化率达99.5%以上；从所述菌株的复合酶中纯化的虎杖糖苷水解酶，并转化98%的虎杖苷为白藜芦醇，转化率达99.7%。白藜芦醇纯度达98.5%。本发明专利技术为生产实际提供一种新型复合酶制剂，从根本上解决当前生产升级中酶催化活性不高，转化率低，时间过长，成本高的问题，促进生产实践应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物酶法转化虎杖提取物为白藜芦醇的工艺方法，属于天然活性物质提取及转化的
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技术介绍
白藜芦醇(resveratroLRes)。学名为3，4，5_三羟基二苯乙烯，是蒽醌萜类化合物，物理性质为无味、白色晶体粉末；难溶于水，易溶于乙醇，丙酮等有机溶剂。白藜芦醇主要存在于虎杖、葡萄、花生、松树等植物。白藜芦醇具有抑制肿瘤、抗氧化、抗自由基、抗血栓、抗过敏、抗动脉粥样硬化和具有冠心病、缺血性心脏病、高血脂症的防治作用，白藜芦醇已被列为抗心血管、抗癌最有前途的药物之一。目前国际上白藜芦醇已被广泛应用，导致了白藜芦醇需求的大幅增加。由于化学合成白藜芦醇的工艺还不成熟，其所需白藜芦醇仍源于天然植物。当今国内学者优选的白藜芦醇的提取方法多是用有机溶剂或水从虎杖 {Polygonum cusp i da turn Sieb. et Zucc.， P. cusp i datum)中提取白藜戸酉享苷(polydatin, PD)，又叫虎杖甙，虎杖甙物理性质为白色针状结晶粉末，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯，微溶于水。再用酸、碱或酶法解去甙上的糖，转化为甙元而成。虎杖甙的含量随产地不同差异较大，一般含量在1 4%。经文献和专利查新，已有文献和专利报道从虎杖甙制备白藜芦醇苷的方法。如中国专利申请号201010022075. 1采用专用固定化酶对虎杖材料粗提液进行生物转化，短时间内使其中白藜芦醇类似物转化为白藜芦醇，然后采用萃取分离技术获得高纯度的白藜芦醇。本专利技术可提高虎杖材料中白藜芦醇含量10-20倍，避免了同类技术中转化时间过长、催化时间不易控制以及反应完成后酶无法回收造成成本提高的问题，同时采用层析、结晶等分离、精制技术，获得大于95%的白藜芦醇和一定纯度的副产物大黄素两种产品。田天丽的论文(四川大学学报，2008)从中药材虎杖中筛选到一株具有转化虎杖苷能力的根霉菌株 T234，利用该菌株产生的葡萄糖苷酶能将虎杖苷转化为白藜芦醇.转化率达98 %。尽管相关专利申请和研究论文较多，但仍然不能很好解决酶催化活性不高，转化率低，时间过长，成本高的问题，难以有效应用生产实际。
技术实现思路
本专利技术的目的就针对上述缺陷，从虎杖内生菌中筛选到一株高效转化虎杖苷为白藜芦醇的微生物菌株。从根本上解决酶催化活性不高，转化率低，时间过长，成本高的问题，促进生产实践应用。
技术实现思路
之一.提供一种能发酵生产虎杖糖苷水解酶并高效转化虎杖苷为白藜芦醇的微生物菌株，该菌株经分子生物学和形态学鉴定为棘孢曲霉 acWmim)，该菌株2010年5月观日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号，CGMCC No. 3876。在一个实施方案中，其中说述菌株的筛选过程从各地采野生虎杖样品，采用虎杖提取物配制不同的培养基，从虎杖内生菌中进行筛选，将刚采集的新鲜虎杖的根状茎在自来水下冲洗干净，浙干水分，切割成2 3 cm小段，按常规无菌操作进行如下表面消毒处理 75%酒精漂洗；Γ5 s，0. 1%升汞漂洗圹5 min，无菌水冲洗4飞次。将上述处理过的根状茎在无菌条件下剥开取其韧皮部，将韧皮部外围剪去，再剪切成0.5 cmX0.5 cm的小片，放置于PDA平板上，每个平板放置4块，30°C培养3 7 d后，即见样品剪切过的边缘有真菌菌丝长出，真菌菌丝经纯化后转接到PDA斜面上培养好后备用。将保存至斜面上的菌种发酵，检测其粗酶液转化PD生成Res的效果，进行复筛。筛选到多个菌株，逐一复筛进行虎杖糖苷水解实验，得虎杖糖苷水解酶高活性菌株，进行菌种签定。在另一个具体实施方案中，所述菌株棘孢曲霉Usper识7ΛΛ5. acWeaim)，CGMCC No. 3876的形态特征为菌丝无色、淡色或表面凝集有色物质，有隔膜。分生孢子梗从壁厚而膨大的菌丝细胞垂直生出，大多数无隔膜，光滑或粗糙，上部较粗大，顶端膨大成球形、椭圆形、半圆形或棍棒形的泡囊；从泡囊的全部表面以放射状生出小梗或仅在泡囊顶部产生小梗；小梗单层或在顶部再分枝成2个至多个的小梗。分生孢子串生于小梗顶端，作辐射状排列或丛集成柱形，着褐色、形状、大小和纹饰的变化很大。
技术实现思路
之二 . 提供所述菌株棘孢曲霉(Aspergillus, aculeatus)，CGMCC No. 3876发酵制备的胞外酶。所述菌株胞外酶是一组复合酶，其中包括纤维素内切酶，纤维素外切酶，木聚糖酶以及虎杖糖苷水解酶等。在一个实施方案中，所述菌株胞外酶发酵制备方法是，用无菌培养基(配方3% 6%麸皮、0. 5 1. 0%蛋白胨、起始pH 5 6)接种棘孢曲霉CGMCC No. 3876，在沘 30°C 条件下好氧发酵3 3. 5天，发酵一层纱布液经过滤、5000 10000转/min离心，上清液用截留分子量为5000 Da中空纤维膜浓缩5倍，浓缩液为胞外酶粗酶液。
技术实现思路
之三.采用所述菌株发酵制备的胞外酶，提供一种酶法提取虎杖苷及其类似物，并结合常规醇提和水提方法获得虎杖苷及其类似物粗提液的方法及其用途。所述菌株胞外酶法酵制备工艺包括用棘孢曲霉CGMCC No. 3876胞外酶粗酶液与 60 80目的虎杖干粉调浆，胞外酶粗酶液与虎杖干粉比例为1.5 mL:l g;在35 40°C条件下酶法水解3 4小时；再补充5 6倍体积用95%工业酒精浸提3次，每次1. 5 2小时，合并浸提液；将浸提液用常规方法挥干，获得虎杖苷及其类似物粗品。酶法提取虎杖苷及其类似物，提取率为2. 3% ；未加所述菌株棘孢曲霉的胞外酶(对照)提取虎杖苷及其类似物，提取率仅为1. 2%，处理提高了 91. 7%。在另一个具体实施方案中，用于提取的植物材料可以是富含白藜芦醇苷的虎杖、 花生、葡萄等。
技术实现思路
之四.从所述菌株发酵制备的胞外酶中提供高效转化虎杖苷为白藜芦醇的虎杖糖苷水解酶及其用途。包括⑴所述菌株棘孢曲霉CGMCC No. 3876的虎杖糖苷水解酶的需分离纯化，分离纯化方法可以是硫酸铵沉淀、离子交换层析、葡聚糖凝胶层析、亲和层析，也可以是活性凝胶电泳二步循环法(NGGEE) ，-40°C冻干并获得纯度为98%以上的虎杖糖苷水解酶。该酶的酶学特性为由一个亚基组成，亚基分子量为27. 3 kDa，等电点pi 4. 65，最适反应度40°C，最适反应pH 5. 0, K =5 mg/mL虎杖苷。虎杖糖苷水解酶比活力达1783. 6 IU/ (mg protein)⑵用蒸馏水配制1% 5%过饱和的虎杖糖苷水溶液(虎杖糖苷原料含量98%以上)， 加入0. 5% 1%，纯度为98%以上的所述虎杖糖苷水解酶，在pH 5. 0，40°C条件下水解虎杖糖苷，并不断搅拌，水解3 6 h，获得过饱和的白藜芦醇过饱和水溶液。虎杖糖苷在水溶液中溶解度很低，在过饱和状态下，虎杖糖苷被所述虎杖糖苷水解酶源源不断水解为白藜芦醇。由于白藜芦醇溶解度比虎杖糖苷溶解度更低，过饱和的白藜芦醇水溶液不断有白藜芦醇析出，在此机制下，虎杖糖苷几乎完全水解为白藜芦醇，转化率达99. 5%以上。经常规的离心过滤，蒸发浓缩获得高纯度的白藜芦醇，纯度达98. 5%。在一个具体实施方案中，底物还可以是富含白藜芦醇苷的虎杖、花生、葡萄等浸提的白藜芦醇苷粗本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：林元山，庞一林，邹冬生，杨祖佑，
申请(专利权)人：林元山，
类型：发明
国别省市：
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