本发明专利技术涉及一种用于生产新型微生物源杀菌剂的生物工程菌株及其应用。本发明专利技术的用于生产微生物源杀菌剂的生物工程菌株，为将phzH基因重组表达质粒转化入产吩嗪-1-羧酸的菌株后获得，所述生物工程菌株产吩嗪-1-羧酸酰胺。本发明专利技术利用现有的生产吩嗪-1-羧酸的菌株携带phzH基因重组表达质粒，实现phzH基因的高效表达,并将吩嗪-1-羧酸转化为吩嗪-1-羧酸酰胺。本发明专利技术还进一步公开了所述生物工程菌株的用途，包括由所述生物工程菌株发酵生产的微生物源杀菌剂及该微生物源杀菌剂的制备与应用。吩嗪-1-羧酸酰胺的抗菌活性不受其使用条件的酸度值影响，从而稳定其抗菌活性，能更加有效地防治作物病害。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物源农药生产
，尤其涉及一种用于生产新型微生物源杀菌剂的生物工程菌株及其应用。
技术介绍
农作物病害引起的损失幅度约占总产量的25 75%，以我国主要的粮食作物水稻为例，每年种植面积约4亿亩，按亩产量400公斤，水稻病害平均引起减产10%计，每年造成经济损失达300多亿元人民币之巨，严重威胁粮食作物的安全生产。目前，生产上控制植物病害除了选用良种和改进栽培措施外，主要依靠喷洒化学杀菌剂。目前使用的大多化学杀菌剂对人体和动物具有不同程度的毒害作用，残留在植物可食部分的有害成份会对人体健康造成潜在威胁，已经引起政府和社会各阶层的关注；不仅如此，有些化学农药难以分解，会长期地累积在生态系统中，造成对环境的污染，不利于社会经济的可持续发展；而且， 现有的化学农药对某些植物病害并不完全有效。因此，在努力发展新一代化学农药的同时， 还需要大力研究和发展高效、安全、经济、对环境相容性好的生物源农药。目前，在生产上已经推广使用的生物源农药，其种类和数量都较少，有些品种则由于使用年久，引起了植物病原菌的抗药性，防治效果不够理想。以水稻纹枯病为例，防治该病害的药剂主要依赖于老牌生物源农药井岗霉素。但是，经过将近40年的长期使用，部分水稻纹枯病菌的融合群已产生抗药性；而且，井岗霉素仅对水稻纹枯病菌有效，对其他病原菌没有明显的防治效果，使用范围具有很大的局限性。生物农药促生拈抗菌M18，对植物病害具有高效、安全、广谱的杀菌作用，与环境相容性好，易于在环境中解体。该促生拈抗菌M18已于2000年6月27日在中国专利局指定的保藏单位北京，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为 CGMCCN0. 0462。生物农药促生拈抗菌M18的制备和应用，已经获得国家专利技术专利，专利号为 00119857. 2。但是，生物农药促生拈抗菌M18是一种活菌菌剂，其作用机理主要是通过M18 活菌合成抗植物病害的活性成分实现对农作物植物病源菌的抑制作用，其合成的活性成分含量容易受到菌体本身的代谢调控机制和环境条件的影响。因而，对植物病害的防治效果具有不稳定性的缺陷，难以在农业生产中进行大规模的推广应用。已经查明，促生拈抗菌M18防治植物病害的主要活性成分是吩嗪-1-羧酸，从促生拈抗菌M18的发酵液中提取吩嗪-1-羧酸，利用活性成分而不是活菌对农作物病害的防治同样具有高效、安全、广谱、与环境相容性好等特征；同时，能克服利用促生拈抗菌M18防治病害效果不稳定性的缺陷。但是，利用促生拈抗菌M18发酵，合成活性成分吩嗪-1-羧酸的效价很低，仅为每升200毫克左右，如何提高发酵效价，降低使用成本，成为开发本产品的瓶颈所在。近年来，我们已经运用分子生物学的技术，对促生拈抗菌M18合成吩嗪-1-羧酸的调控机制，开展深入地研究。在此基础上，运用基因工程手段，对促生拈抗菌M18基因组中的双组分调控基因gacA开展了定向失活突变，获得了 M18衍生菌株M18G，大大提高了吩嗪-1-羧酸的产量，使其发酵效价达到每升1500-1700毫克左右。该研究成果的技术方法已经于2004年在《微生物学报》44卷第761 765页公开，论文题目为《假单胞菌gacA插入突变对藤黄绿菌素和吩嗪-1-羧酸合成代谢的差异性调控》。在2006年，名称为“利用促生拈抗菌M18衍生菌株制备杀菌剂的方法”的中国专利技术专利中(专利号ZL200610023459. 9)， 提供一种了利用促生拈抗菌M18衍生菌株M18G和M18R制备杀菌剂的方法，利用微生物的代谢产物而非微生物活体制备杀菌剂，通过两种衍生菌株的代谢产物的复配，达到提高防治效果的目的。2009年，我们又专利技术了利用工程菌株M18G携带质粒pME6032Phz生产吩嗪-1-羧酸的方法，能使吩嗪-1-羧酸的发酵效价达到每升5700 6600毫克的水平，进一步降低生产成本，实现在农业生产的大规模推广应用。该项技术已经获得国家专利技术专利，专利号ZL200910198664.2。以吩嗪羧酸为主要成分的微生物源杀菌剂，我国农药命名单位已经定名为申嗪霉素。申嗪霉素原药和1 %申嗪霉素悬浮剂于2011年获得了农业部颁发的正式登记证(登记号PB20110314和PB20110315)。农业部已经将申嗪霉素列入“十二五” 期间全国推广产品(证书号TG2011-002)。但是，吩嗪-1-羧酸对病源菌的防病作用与使用时的酸度(pH)值密切相关，在PH 值7. 0的条件下，其抗菌活性仅为pH值5. 0条件下的20%，大大降低了吩嗪-1-羧酸在碱性条件下的防病效果。同时发现，促生拈抗菌M18及其衍生菌株M18G的基因组中，phzH基因是一个已经发生突变的失活基因。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术中存在的缺陷，提供一种用于生产新型微生物源杀菌剂的生物工程菌株及其应用技术。本专利技术利用生产吩嗪-1-羧酸的菌株，携带能表达PhzH基因、编码产生WizH(glu taminephenazine-l-carboxylic acid amidotransferase, IjtI^ 1 )" W^MiW^!^ 酶，PhzH)的重组表达质粒，补充并添加phzH基因的拷贝数，并在工程菌株中进行表达，将吩嗪-ι-羧酸转化为吩嗪-ι-羧酸酰胺。吩嗪-ι-羧酸酰胺的抗菌活性不受其使用条件的酸度值影响，从而稳定其抗菌活性，能更加有效地防治作物病害。本专利技术首先公开了一种用于生产微生物源杀菌剂的生物工程菌株，为将phzH基因重组表达质粒转化入产吩嗪-1-羧酸的菌株后获得，所述生物工程菌株产吩嗪-1-羧酸酰胺。本专利技术还公开了所述用于生产该微生物源杀菌剂的生物工程菌株的构建方法，包括下列步骤1)扩增PhzH基因片段；2)将扩增的phzH基因片段插入表达载体中构建成phzH基因重组表达质粒；3)将构建的phzH基因重组表达质粒导入产吩嗪-1-羧酸的菌株，构建成所述用于生产微生物源杀菌剂的生物工程菌株。所述phzH基因重组表达质粒为克隆有phzH基因片段的重组表达质粒。所述phzH 基因重组表达质粒能在所述产吩嗪-1-羧酸的菌株中表达phzH基因，编码产生WizH (谷酰胺吩嗪-ι-羧酸酰胺转移酶)。本专利技术所述的phzH基因包含phzH基因的编码区及其非编码区。所述的phzH基因片段可以是完整的phzH基因也可以是phzH基因的一部分。本专利技术所述的PhzH基因片段应至少包含phzH基因的完整编码区。较佳的，为利于高效表达为PhzH，所述phzH基因片段包含phzH基因的完整编码区及其5，端的非编码区。所述phzH 基因片段所包含的5’端的非编码区可以为部分的或是完整的phzH基因5’端非编码区。 所述PhzH基因片段所包含的phzH基因5’端非编码区应当有利于WizH的表达。优选的， phzH基因片段所包含的5’端的非编码区含有自phzH基因翻译起始密码子上游第1位碱基始至其上游第683位碱基止的多核苷酸片段。进一步的所述WizH为假单胞菌的WizH。所述phzH基因片段为假单胞菌的phzH基因片段。优选的，所述假单胞菌为铜绿假单胞菌(I^eudomonas aeruginosa)或绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)。具体可本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：许煜泉，申慧峰，何亚文，周万平，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：
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