本发明专利技术公开了一种EGFR与HER2联合多肽表位疫苗，将HER家族HER2的两个B细胞表位模拟多肽I和II、HER家族EGFR的一个B细胞表位模拟多肽以串联的形式插入到乙肝核心抗原HBcAg的第78位氨基酸与第79位氨基酸之间，构成的融合蛋白即为联合多肽表位疫苗。本发明专利技术的EGFR与HER2联合多肽表位疫苗，突破了现有单一表位疫苗的局限，使联合表位疫苗具有更广泛的抗肿瘤活性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医药生物
，具体说，涉及一种利用基因工程技术制备EGFR与 HER2联合多肽表位疫苗。
技术介绍
HER家族是一类表皮生长因子受体(EGFR)家族，其家族成员有EGFR(HER1或 ErbBl)，HER2 (neu 或 ErbB2)，HER3 (ErbB3)和 HER4 (ErbB4)。HER 家族普遍表达于人体的表皮细胞和基质细胞，能够调节正常细胞的增殖和分化，而其不正常的激酶活性的活化能导致肿瘤细胞的发生和增值，血管发生和转移等，因此，在乳腺癌，非小细胞肺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌等上皮源性肿瘤细胞中，可以检测到该家族及其突变体的过表达。鉴于此， 众多研究者将HER家族作为治疗肿瘤的靶分子。HER家族是一类巨大的I型跨膜糖蛋白，都有一个同源性很高的胞外配体结合区， 一个跨膜螺旋区以及一个结构保守但功能不一的胞内酪氨酸激酶结构域。其中，只有EGFR 和ErbB4在配体结合与激酶活性上是功能完全的。ErbB3没有激酶活性，活化需要依赖其异二聚体配偶体活性；ErbB2不能与已知的任何一个ErbB配体结合，但能在形成异二聚体后发挥其潜在的激酶活性，并且在有丝分裂信号中ErbB2和ErbB3是最有效的异二聚体。 HER家族配体可根据其与受体是否直接结合而划分，与EGFR结合的配体有表皮生长因子 (EGF)，肝素结合EGF样生长因子(HBEGF)，转化生长因子α (TGF α )，双向调节蛋白(AR， amPhiregulin)，表皮调节素(EpR)，β-细胞素(BTC, betacellulin)等，与 ErbB3，ErbB4 结合的配体是 neuregulin (NRG)。在过去的十几年里，大部分研究均集中在EGFR和HER2激酶活性的失调引起的肿瘤发生，近年来，HER3的作用受到了越来越多的重视，由于HER3缺乏酪氨酸激酶活性，以及依赖于HER3的PI3K/AKT途径的持续活化，使得肿瘤细胞能够逃脱凋亡和生长抑制，且大量证据表明，HER2的直接信号配偶体HER3在HER2介导的肿瘤发生中发挥着重要作用。抗HER家族的药物如单克隆抗体，小分子抑制剂等，鉴于上述，由于可变ErbB信号通路的活化，长期使用这些小分子抑制剂会产生抗药性。而且使用单克隆抗体进行治疗， 费用昂贵，而且要达到有效的滴度，被动抗体治疗必须长时间重复施药。因此，寻求更加有效的抗HER家族药物成为国内外研究者一直不断探索的目标。国内外对HER家族的研究主要集中于以下几个方面1)制备各种针对HER家族的单克隆抗体如EGFR的单克隆抗体cetuximab(IMC-225) ；HER2的单克隆抗体 Trastuzumab (Herceptin)。这些单克隆抗体虽然已被FDA批准用于某些癌症的治疗，但由于其价格昂贵，且被动抗体治疗必须长时间重复施药，很难在市面推广。2)寻找有效靶位点制备各种小分子抑制剂Gefitinib (ZD1839，Ierssa)，是最早进人临床研究的EGFR酪氨酸激酶抑制剂。由于长期使用这类小分子抑制剂，导致抗药性的产生。3)利用siRNA技术阻断HER家族受体的表达Gunamani Sithanandam 等人用 HER3siRNA 处理 A549 细胞(该细胞中 HER3 对其分裂，存活和迁移等起主要作用)，48h后，细胞数量下降，并且成剂量依赖性，这是因为siRNA 阻断了细胞周期，引起细胞的编程性死亡和坏死。4)制备各种针对HER家族的疫苗关于HER家族的疫苗，国内外已经有诸多报道。Angelika B. Riemer等用噬菌体展示技术从循环的十倍体多肽库中筛选出多肽，该肽模拟了能被cetuximab识别的表位， 从而制备出针对EGFR的表位疫苗，体外实验证实其产生的抗体与cetuximab生物学特性相似。但这些疫苗都是单一的，只针对HER家族某一成员作用，对其他HER家族成员的作用则各有局限。 表位疫苗(印itope vaccine)是用抗原表位制备的疫苗。表位(epitope)是抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，又称抗原决定簇(antigenic determinant)，它是 T细胞抗原受体(T cell receptor,TCR)和B细胞抗原受体(B cell receptor,BCR)及抗体特异结合的基本单位。在免疫应答中，TCR和BCR所识别的抗原表位不同，分别称为T细胞表位和B细胞表位。表位是抗原引起免疫应答的关键部分，表位疫苗正是基于这一理论基础提出来的。根据表位的不同，表位疫苗分为B表位疫苗、T表位疫苗和兼具两种表位的多表位疫苗。表位疫苗具备不少传统疫苗技术所不具备的优势，相对灭活减毒疫苗而言，它容易生产，摆脱了体外培养的限制；相对基因工程亚单位疫苗而言，它不包含任何病原生物的完整组分，彻底摆脱了潜在的威胁。且表位疫苗能通过随机肽模拟糖分子表位，这是基因工程亚单位疫苗所无法实现的。因而，表位疫苗是目前研制感染性疾病和恶性肿瘤疫苗的方向。由于缺乏天然蛋白的三维结构，表位疫苗的分子小，免疫原性差，半衰期短，使机体无法产生免疫反应，还可能引起免疫耐受，因此选择乙肝病毒抗原(HBcAg)作为表位疫苗的载体可以解决这一问题，而且该载体由于其优越性越来越受到国内外研究者的欢迎。HBcAg是由乙型肝炎病毒基因组的C区基因编码一个氨基酸多肽。HBcAg全长由 183个氨基酸组成，但只有N端的149个氨基酸是其在细菌中自组装成病毒颗粒是必须的。 HBcAg N端第78-83位，第127-133位氨基酸残基位于颗粒表面，并且前者是刺突尖部的组成部分。HBcAg作为一种颗粒性抗原，易被抗原呈递细胞(APCs)摄取、加工、处理及呈递，能激发机体较强体液及细胞免疫应答，具有直接激活细胞应答的作用，又具有激活细胞的表位，还可以自身凝聚成颗粒，故被认为是理想的免疫载体。研究证实，在HBcAg的第73-94位两保守甘氨酸间插入目的肽段的免疫原性最为理想，因为该区域位于颗粒表面，去除该区域的某些特定氨基酸后，可以废除本身的免疫原性，同时增强插人片断的免疫原性，而且， 该区域可以插人肽段的长度多达120个氨基酸。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种EGFR与HER2联合多肽表位疫苗，以突破现有单一表位疫苗的局限，使联合表位疫苗具有更广泛的抗肿瘤活性。为解决上述技术问题，本专利技术的思路是选择1个EGFR，2个HER2三个B细胞表位模拟多肽，并以乙肝核心抗原(HBcAg)为载体，制备HER家族联合多肽表位疫苗。 具体的技术方案如下 一种EGFR与HER2联合多肽表位疫苗，将HER家族HE R2的两个B细胞表位模拟多肽I和II、HER家族EGFR的一个B细胞表位模拟多肽以串联的形式插入到乙肝核心抗原 HBcAg的第78位氨基酸与第79位氨基酸之间，构成的融合蛋白即为联合多肽表位疫苗；其中，所述的HER家族HER2的B细胞表位模拟多肽I，其氨基酸序列如SEQ ID No 2所示，编码该氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID No 1所示；所述的HER家族HER2的B细胞表位模拟多肽II，其氨基酸序列如SEQ ID No :4所示，编码该氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID No 3所示；所述的H本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种ＥＧＦＲ与ＨＥＲ２联合多肽表位疫苗，其特征在于，将ＨＥＲ家族ＨＥＲ２的两个Ｂ细胞表位模拟多肽Ｉ和ＩＩ、ＨＥＲ家族ＥＧＦＲ的一个Ｂ细胞表位模拟多肽以串联的形式插入到乙肝核心抗原ＨＢｃＡｇ的第７８位氨基酸与第７９位氨基酸之间，构成的融合蛋白即为联合多肽表位疫苗；其中，所述的ＨＥＲ家族ＨＥＲ２的Ｂ细胞表位模拟多肽Ｉ，其氨基酸序列如ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２所示，编码该氨基酸序列的核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１所示；所述的ＨＥＲ家族ＨＥＲ２的Ｂ细胞表位模拟多肽ＩＩ，其氨基酸序列如ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４所示，编码该氨基酸序列的核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３所示；所述的ＨＥＲ家族ＥＧＦＲ的一个Ｂ细胞表位模拟多肽，其氨基酸序列如ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：６所示，编码该氨基酸序列的核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：５所示；９所示。所述的乙肝核心抗原ＨＢｃＡｇ，其氨基酸序列如ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：８所示，编码该氨基酸序列的核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：７所示；所述的融合蛋白，其氨基酸序列如ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１０所示，编码该氨基酸序列的核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：胡春萍，曹鹏，卢悟广，蔡雪婷，王志刚，季夏芸，胡云龙，
申请(专利权)人：江苏省中医药研究院，
类型：发明
国别省市：84
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