有效利用氮的转基因植物制造技术

本发明专利技术涉及分离自水稻（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ）（Ｒａｓｉ变体）的谷氨酸脱羧酶（ＧＡＤ）基因序列以及其对应的编码多肽，它们产生提高植物氮利用效率的性状。本发明专利技术还涉及这些核酸分子和多肽在制备氮利用效率提高的转基因植物、植物细胞、植物材料或植物种子中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
分离白水稻(Oryza saliva)的谷氨酸脱羧酶(GAD)基因序列及其在植物中增强氮摄取和氮利用效率中的用途。
技术介绍
作物植物已有近10000年的历史，并且大多数时间没有强力施肥。然而，近50年间，世界范围内作物的氮肥使用量增加了超过20倍。这些肥料的使用效率不佳，因为仅有约50%在植物收获中被回收。作物植物并未在高氮营养条件下进化，许多机制不一定适合在这种营养条件下的生长。因此问题在于，根据已有知识和实验，能否提高作物植物的氮利用效率？有两种可能方式，一是充分利用基因库中氮利用特征的可用变化，二是尝试引入可能增加这种变化的新基因。增加植物的氮利用效率产生多种有益影响。例如，有效利用氮的植物在贫氮土壤中能够生长，并且比常规植物产量更好。有效利用氮的植物减少对于施用氮肥的需求。施肥占了作物生产费用的一大部分，因此减少肥料的使用将直接导致节约费用。减少施肥还将减少氮肥广泛应用造成的环境损害。这些使用氮肥对环境造成的不利影响表现在增加水体富营养化、酸雨、土壤酸化和温室效应。现有技术基础植物生物化学和生理学提供了更好了解作物生产系统与N供应之间关系的方法。二氧化碳(CO2)和硝酸盐(NO3_)同化的相互作用及动态对于作物生产至关重要。 NO3-的充足供应，同化为氨基酸(这需要光合成碳化合物)和及其对于蛋白质合成的可用性是代谢所必需。NO3-充足供应刺激叶片生长和光合成，前者通过细胞生长和分裂实现，后者则由光反应组分的较大成分以及CO2同化和相关步骤实现。然而，代谢和产量之间的联系少有量化。必须更好的使用生化特征和刺激模型并将其组合以改进N肥应用、N使用效率和产量。使用遗传学全部潜能，以及充足的N，每单位N更多的C同化，将增加生物量。遗传学潜能可定义为当没有环境限制时，植物形成生物量或产量的全部能力；育种家和农学家经常提到产量潜能，但在考虑如何增加作物的潜在生长时，总产量更加切合。 产量潜能与遗传信息相关联，它说明了蛋白质的特征，因此确定了结构、生长和发育以及系统能够生长的大小。生长周期中的最大尺寸成为遗传学潜能。关键点是当N供应低于达到遗传学潜能所需时，必须提高N摄取以得到更高的生物量。或者，可增加每单位蓄积N的C同化，以从更小的N蓄积中得到更高的生物量。理论上通过增加每单位N蓄积的C同化，可增加产生生物量的遗传学潜能，其代价是增加C/N比值。前提是光能量充足。如果同化了更多的N，但不改变与C同化的平衡，理论上可增加生物量并保持当前的C/N比。植物学家长久以来意识到需要开发出更加有效吸收和利用营养的作物。两种方法用于增加作物植物的营养利用效率(NUE)。第一种方法包括传统育种，以及标记物辅助选择以鉴定涉及的基因。第二种方法使用经设计提高NUE的特定方面的新基因构建物。硝酸盐还原酶氮同化通路中两个连续的酶催化步骤将硝酸盐还原为氨。首先硝酸盐还原酶(NR) 将硝酸盐转化为亚硝酸盐，然后亚硝酸盐从胞质转运到叶绿体，在叶绿体中被亚硝酸盐还原酶(NiR)还原为氨。植物中NR基因的表达受多种内源和环境因素影响，并且在转录、翻译和翻译后水平高度受到调控。总之，在分析的组织中，NR过表达似乎降低亚硝酸盐的水平。在植物中过表达NR或NiR基因能增加mRNA水平，并常常影响N摄取。然而，无论可用的氮源如何，N摄取的增加似乎都不提高植物的产量或生长。这被认为部分是因为NR调节和整体通路调节的复杂性。谷胺酰胺合成酶和谷氨酸合酶在高等植物中发现了氨同化中的重要酶对谷胺酰胺合成酶(GS)和谷氨酸合酶 (GOGAT)之后，多个实验室聚焦于理解该通路的调控机理。此外，已产生GS/G0GAT水平改变的突变体或转基因植物以确定这些蛋白质在植物发育中的效应，并研究GS多基因家族不同成员的表达。多个研究表明转基因植物中GS 活性增强与生物量或产量的直接相关性。与GS相比，很少有报道描述过表达GOGAT的转基因植物的产量。过表达苜蓿GOGAT基因的转基因植物显示GOGAT蛋白含量增加，但没有表现任何与此性状相关的表型。GABA 旁路Y-氨基丁酸(GABA)是含四个碳原子的非蛋白质氨基酸，在细菌、植物和脊椎动物中具有保守性。GABA是游离氨基酸池的重要组分。GABA在γ碳而非α碳上具有氨基， 以未结合的形式存在。它具有高水溶性。就结构而言，它是柔性分子，可在溶液中采取若干构象，包括与脯氨酸1类似的环状结构。GABA在生理ρΗ值(ρΚ值为4. 03和10. 56)下为两性离子(同时携带正电荷和负电荷)。这于半个多世纪前在植物中发现，但揭示GABA在大脑中以高水平产生并在神经传递中发挥主要作用时，对GABA的兴趣转移到了动物上。此后，在脊椎动物中对GABA的研究就主要集中在其作为信号传导分子特别是在神经传递中的作用上。在植物和动物中， GABA主要经包含三种酶的短途径进行代谢，所述短途径称为GABA旁路，因为它绕过了三羧酸(TCA)循环中两个步骤。所述途径包含胞质酶谷氨酸脱羧酶(GAD)与线粒体酶GABA氨基转移酶(GABA-T)和琥珀酸半醛脱氢酶(SSADH)。该保守代谢途径的调节在植物中似乎具有特定特征。经GABA将谷氨酸转化为琥珀酸的途径称为GABA旁路。该旁路的第一步是通过谷氨酸脱羧酶(GAD，EC 4. 1. 1. 15)对谷氨酸进行直接和不可逆的α -脱羧化。已在多个植物种类和组织的粗提物中对体外GAD活性进行了表征(Brown和Shelp，1989)。GAD对 L-谷氨酸具有特异性，具有吡多醛5’-磷酸依赖性，受已知与巯基反应的试剂的抑制作用， 具有钙调蛋白结合结构域，显示约-5. 8的明显酸性的最适宜ρΗ。已鉴定了来自矮牵牛花 (Baum 等，1993)、番茄(Gallego 等，1995)、烟草(Yu 和 Oh, 1998)和拟南芥(Zik 等，1998) 的GAD基因。参与GABA旁路的第二个酶是GABA氨基转移酶(GABA-T ；EC 2. 6. 1. 19)，其将丙酮酸或a-酮戊二酸作为氨基受体，催化GABA可逆地转化为琥珀酸半醛。在粗提物中，相对于α-酮戊二酸，体外GABA-T活性似乎更愿选择丙酮酸。然而，烟草叶的粗提物中存在不同的丙酮酸依赖性和α “酮戊二酸依赖性活性，它们可通过离子交换色谱进行相互分离(Van Cauwenberghe和Shelp)。两种活性显示的最适宜pH很宽，为8_10。来自烟草的纯化约1000倍的丙酮酸特异性线粒体GABA-T的米氏常数(Km)就GABA为1. 2mM,就丙酮酸为 0. 24mM(Van Cauwenberghe 禾口 Shelp)。GABA旁路的最后一步由琥珀酸半醛脱氢酶(SSADH ；EC 1. 2. 1. 16)催化，不可逆地将琥珀酸半醛氧化为琥珀酸。所述部分纯化的植物酶具有约为_9的碱性最适宜pH，与NAD 的活性最多是与NADP的活性的20倍(Shelp等，1995)。实际上，对植物中GABA旁路的兴趣主要来自关于GABA主要在对生物性胁迫和非生物性胁迫作出应答时快速产生的实验观察。从此将GABA旁路与各种生理应答联系起来， 包括胞质PH调节、TCA循环碳流入、氮代谢、阻止昆虫、针对氧化胁迫的保护作用、渗透调节和信号传导。本专利技术中，我们将植物中自从发现本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种产生氮含量升高或氮利用效率增高的转化植物的方法，包括：将包含与编码功能性谷氨酸脱羧酶（ＧＡＤ）的核苷酸序列操作性连接的启动子的ＤＮＡ构建物掺入植物基因组中。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：V·M·帕特尔，
申请(专利权)人：阿维斯塔根有限公司，
类型：发明
国别省市：IN