描述了用于通过控制纳米沉淀过程中的ｐＨ来从蛋白源产生非免疫原性纳米颗粒的方法。由所公开的方法产生的纳米颗粒的直径尺寸在约１００ｎｍ至约４００ｎｍ的范围，且优选的直径尺寸是约１００ｎｍ至约３００ｎｍ，由此使颗粒为非免疫原性的。本发明专利技术还公开了用于产生适于各种治疗、诊断和其他用途的纳米结合物的方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及形成纳米颗粒的方法，且具体涉及由基于不溶于水的疏水蛋白的聚合 物形成纳米颗粒以产生用于药物、治疗和诊断应用中的非免疫原性递送系统的方法。背景本文中讨论的参考文献仅仅是为了描述与本专利技术有关的领域而提供的。本文中没 有内容应被解释为承认专利技术人没有资格通过现有专利技术来预测公开内容。玉米醇溶蛋白(zein)是从玉米或玉蜀黍(maize)分离的植物蛋白且属于醇溶谷 蛋白类，醇溶谷蛋白类包括大量的疏水性氨基酸，诸如脯氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺。玉米 醇溶蛋白是澄清的、无味的、无毒的、可生物降解的和不溶于水的。玉米醇溶蛋白已经被研 究且在药品、医疗、食品、化妆品、粘合剂和包装行业中用作聚合物。在食品和药品行业，玉米醇溶蛋白已经用于如膜涂覆材料且用于形成颗粒体系， 诸如微粒或纳米颗粒。已经提出了形成玉米醇溶蛋白颗粒的多种方法。例如，美国专 利5，330，778讨论了使用玉米醇溶蛋白来制备微粒的方法，并采用pH调节来形成玉米醇溶 蛋白微粒W]，该专利的内容并入本文。然而，美国专利5，330，778中描述的方法产生了具 有较大的微米尺寸且具有宽的粒度分布的玉米醇溶蛋白颗粒，这于例如体内应用具有显著 的缺陷。重要的是确保用于人类或动物应用的生物材料是安全的和非免疫原性的。一般而 言，当体内施用(如，引入体内)颗粒时，血液和组织内的负责免疫识别和去除外来颗粒的 吞噬细胞可以根据颗粒的物理化学特性来引发免疫应答。吞噬细胞的摄取取决于外来颗粒 的粒度和表面疏水性。一般而言，直径尺寸范围大于约500nm的颗粒是易于吞噬的。具有 疏水性表面的颗粒易于被吞噬细胞识别。例如，Lopez和Murdan 最近报道了直径为 1.36士0. 036 μ m的玉米醇溶蛋白微球是免疫原性的，且因此不适于作为药物、疫苗或其他 治疗载体。专利技术概述在本公开内容的一个方面，本专利技术通常涉及一种用于产生非常小的颗粒或纳米颗 粒的方法。该颗粒可以由不溶于水的疏水蛋白形成，包括例如玉米醇溶蛋白。在本公开内容的另一个方面，方法用于产生减少或基本上克服了在使用大尺寸纳 米颗粒或微粒，包括由例如不溶于水的疏水蛋白形成的那些颗粒时经历的免疫原性的纳米 颗粒。通过控制由本方法形成的颗粒的尺寸以及粒度范围实现了根据本专利技术的方法制备的 纳米颗粒的非免疫原性效应。在本专利技术的一些实施中，颗粒直径尺寸的范围小于约400nm。在本专利技术的优选的实 施中，颗粒直径尺寸的范围小于约300nm，且在一些另外的实施中，颗粒直径尺寸的范围是 约IOOnm至约300nm。虽然此公开内容中是就直径来讨论尺寸的，但是这不应该被解释为意 味着本文中所讨论的纳米颗粒优选是球形形状，虽然可以获得球形形状的纳米颗粒。应该 理解，本文所公开的尺寸可以简单地在颗粒的相对侧之间进行测量，或横跨颗粒的相对侧 的最大尺寸。在本专利技术的一个方面，可以使用可由包括植物、动物或合成来源的多种来源获得 的不溶于水的疏水蛋白来实施本专利技术的方法。在多个方面，可以用醇溶谷蛋白类来实施本 方法，醇溶谷蛋白类包括大量的疏水性氨基酸，诸如脯氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺。这些疏 水性氨基酸使蛋白是不溶于水的。醇溶谷蛋白可以存在于各种谷物中，诸如玉米、小麦、大 麦、稻米、高粱以及其他植物和动物来源中。合适的醇溶谷蛋白的一些示例是玉米醇溶蛋 白、麦醇溶蛋白、大麦醇溶蛋白和高粱醇溶蛋白，虽然本方法的应用不必不限于这些示例。 为了此描述的目的，且仅仅作为本专利技术的一种示例性的阐释，本文中使用玉米醇溶蛋白仅 通过示例的方式描述本方法。在本方法的多个实施中，白玉米醇溶蛋白用于产生在约IOOnm至约400nm的期望 的直径尺寸范围内的纳米颗粒。还发现使用黄玉米醇溶蛋白可以产生具有相对较大的直径 尺寸的颗粒，且还可以产生具有较宽的颗粒直径尺寸分布的颗粒。认为，黄玉米醇溶蛋白中 的色素可以影响黄玉米醇溶蛋白的溶解度和使用黄玉米醇溶蛋白的纳米颗粒形成。本专利技术的方法比其他可能的方式产生具有大体上更小的直径尺寸和更窄的直径 尺寸范围的纳米颗粒。通过使用一种或多种特定级的基础蛋白(base protein)诸如玉米 醇溶蛋白来实施PH控制的纳米沉淀(nanoprecipitation)过程以及通过使用被选择以获 得为纳米颗粒提供非免疫原性的纳米尺寸和直径的缓冲液、表面活性剂和磷脂的不同组合 获得了这些较小的纳米颗粒。本公开内容的方法进一步适合于制备具有变化的物理化学性质的多种分子、颗粒 或试剂的纳米颗粒，以形成具有纳米颗粒的包封的、吸收的、复合的或结合的材料。例如，该 方法可以用于捕获小的亲水性分子、小的疏水性分子和大分子。在这些实例的每一个中，可 以获得约60%至约80%的包封效率。根据本专利技术形成的纳米颗粒可以能够在体外或体内 环境中提供高达一周或可能更长的包封分子(encapsulated molecule)的持续递送。在本专利技术的一个方面，方法用于产生治疗性和/或诊断性的纳米颗粒，如包含抗 癌剂的纳米颗粒。这样的纳米颗粒可以提供活性剂的靶向递送和释放的时间控制，活性剂 通常是治疗剂，诸如小分子药物、核酸、蛋白、疫苗、抗体、化学试剂或其他试剂或物质。除了 所描述的治疗方法外，本专利技术提供了用于产生具有诊断部分的纳米颗粒的方法，所述诊断 部分如成像剂、探针以及类似物。在本专利技术的另一个方面，提供了一种用于根据本专利技术的方法制备纳米颗粒的试剂 盒。该试剂盒包含选定量的水溶蛋白、至少一种缓冲剂和至少一种表面活性剂。该试剂盒 还可以包括水醇溶剂(hydroalcoholic solvent)。该试剂盒还可以包括至少一种磷脂，可 以选择磷脂的量以提供磷脂与表面活性剂的选定比率。附图简述附图说明图1通过流程示了根据本专利技术的方法形成空白的(blank)玉米醇溶蛋白纳米 颗粒的一般步骤。图2通过流程示了根据本专利技术形成负载6，7_羟基香豆素的纳米颗粒的步骤。图3描绘了玉米醇溶蛋白纳米颗粒的不同的电子显微镜的显微照片。图3(a)是 空白的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的扫描电子显微照片。颗粒显示为是球形的且具有光滑的表 面。(比例尺代表Imm = 1. 76μπι。)图3 (b)是空白的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的透射电子 显微照片。(比例尺代表Imm = 8. 038nm。)图3 (c)是负载香豆素的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的扫描电子显微照片。(比例尺代表Imm = 0.87 μ m。)图3 (d)是负载6，7_羟基香豆素 的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的透射电子显微照片。(比例尺代表Imm = 8. 04nm。)图4描绘了根据本专利技术的方法的在空气中以轻敲模式(tapping mode)产生的空 白的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的原子力显微镜(AFM)图像。从左到右是代表性样品的高度、 幅度和相的图像，且分别是14. 19nm的ζ刻度、22. 2V和45°。扫描尺寸(scan size)是 1. 14X1. 14 μ m。以AFM测得50个颗粒的平均粒度是185nm。图5是图示了在冻干之前和之后，缓冲液类型对根据本专利技术的方法制备的负载香 豆素的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的粒度的影响的图。与使用磷酸盐缓冲液相比，在本专利技术的 沉淀法中使用柠檬酸盐缓冲液在冻干之后总是产生较小尺寸的纳米颗粒。Cp <0.05)本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种产生非免疫原性纳米颗粒的方法，包括： 提供不溶于水的疏水蛋白； 用水醇溶剂溶解所述蛋白以提供第一水相溶液； 在表面活性剂和磷脂存在下，将缓冲剂添加到所述第一水相溶液中以产生具有在约ｐＨ ６．８至约ｐＨ ７．４之间的ｐＨ的第二水相溶液； 处理所述第二水相溶液以实现所述溶液内颗粒的直径尺寸的减小； 蒸发任何残余溶剂以产生具有小于约４００ｎｍ的直径尺寸的纳米颗粒；以及 离心所述纳米颗粒。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：奥玛赞努·P·佩鲁马尔，
申请(专利权)人：南达科他州立大学，
类型：发明
国别省市：US
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