快速生物发光检测系统技术方案

提供用于检测报道激酶活性的测定法，其包括：（ｉ）将所述报道激酶添加到测定混合物中，其中所述报道激酶在与ＡＤＰ接触之后不超过数分钟与生物发光试剂接触，并且其中，在报道激酶与ＡＤＰ接触之前，所述测定混合物基本上不含除报道激酶之外的激酶；和（ｉｉ）检测来自所述测定混合物的光输出。还提供了利用上述测定检测分析物在样品中的存在的方法和验证治疗过程的方法。还提供了用于进行这些测定和方法的装置。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】快速生物发光检测系统本专利技术涉及快速生物发光检测系统领域，特别是用于检测报道激酶活性的快速且非常灵敏的生物发光检测系统。还提供用于检测报道激酶活性的生物发光测定、装置、和试剂盒。本领域中已经记述了激酶作为报道酶的应用。例如，本专利技术人已经描述了报道激酶在用于检测分析物在样品中的存在的诊断系统中的应用(参见WO00/46357)，以及在用于验证净化过程的效力的系统中的应用(参见WO2005/093085)。这些报道激酶的活性典型地使用产生光输出信号的ATP生物发光系统(例如，萤光素-萤光素酶)进行检测。所产生的光输出使用发光计测量，并且然后将这些测量与激酶活性的量相关。与报道激酶系统相关的潜在的问题是获得输出信号所需要的时间长度。迄今为止，获得输出信号所需要的典型的时间在30分钟到数小时的范围内。因此，在本领域中存在对更快速和/或简化的报道系统的需求。通过本专利技术解决一个或多个上述问题，在第一方面中，本专利技术提供用于检测报道激酶活性的测定法，其包括：(i)将所述报道激酶添加到测定混合物中，其中所述报道激酶与ADP接触，并且在与ADP接触后不超过5分钟，所述报道激酶与生物发光试剂接触，其中，在报道激酶与ADP接触之前，所述测定混合物基本上不含非报道激酶(即，除报道激酶之外的激酶)；和(ii)检测来自所述测定混合物的光输出。在本专利技术的一个实施方案中，所述方法还包括在适当的数据载体上记录在步骤(ii)中获得的光输出数据的步骤。在本专利技术的另一个实施方案中，所述报道激酶在与ADP接触后不超过2分钟、不超过1分钟、不超过30秒、或不超过10秒与生物发光试剂接触。在另一个实施方案中，所述报道激酶同时与ADP和生物发光试剂接触。因此，在所述报道激酶与ADP接触和与生物发光试剂接触之间没有显著的温育时间(或仅有非常短的温育时间)。因此，可以认为本专利技术利用“一步”生物发光检测方法。与上述快速检测系统相反，常规的报道系统典型地利用“两步”检测方法：在第一步中，将报道激酶暴露于ADP底物来源，并且温育充足的时间以足以允许产生ATP[1]。然后，在第二分开的步骤中，加入萤光素/萤光素酶试剂以通过报道激酶将所产生的ATP转化为光[2]。已经表明该“两步”生物发光测定提供准确的激酶检测。然而，其“两步”性质(即，加入ADP，温育，然后分开加入生物发光试剂)已经证明当在“实地”而不是在实验室设置中进行检测时是麻烦和缓慢的。迄今为止，已经认为这两个反应步骤(上文所示)是不相容的，因为在步骤[2]中产生的AMP推动步骤[1]的平衡偏向左侧，由此有利于在步骤[1]中产生的ATP重新转化成ADP。由于该系统的光信号输出依赖于ATP的存在，这使得激酶活性的检测更加困难。因此，迄今为止，步骤[1]和[2]已经在时间上(即，通过包括上述温育步骤)、或空间上(即，反应在分开的隔间中进行)分开。与这种观点相反，本专利技术人已经发现反应步骤[1]和[2]实际上可以同时进行，而对报道激酶检测的灵敏性没有任何显著的不利影响。所产生的“一步”生物发光测定在速度和便利性方面提供显著的优点，并且在重点照护诊断检测中特别有利，并且快速处理释放指示剂，即，用于在实地而不是在实验室中的激酶活性检测。另外，为了确保检测的高灵敏性和准确性，本专利技术人已经发现确保在加入任何ADP之前，包含报道激酶的样品基本上不含任何非报道(即，污染)激酶活性，和/或任何内源性ATP是有利的。从上述反应方案将清楚，存在这些污染物中的任一种可以显著不利地影响激酶活性检测的灵敏性/准确性。例如，非报道激酶可以将ADP转化为ATP，并且因此产生假的(或增加的)光输出信号。因此，已经发现处理包含报道激酶的样品以去除或灭活任何非报道激酶和/或任何内源性ATP是有利的。在本专利技术的一个实施方案中，使用下述一个或多个处理步骤去除和/或灭活非报道激酶。在这一点上，按照本专利技术被灭活或去除的首选的非报道激酶是哺乳动物、真菌和/或植物激酶(例如，哺乳动物、真菌或植物腺苷酸激酶)。这些处理可以以任何数目(优选一个或多个，或至少两个，或至少三个)和/或以任何组合使用。然而，在所有情形中，所述处理使所述报道激酶基本上完好无损(例如，在激酶活性方面是活性的)。可以将任意一个或多个下述处理步骤应用于本专利技术的任一方面。在一个实施方案中，非报道激酶通过暴露于50-120℃1-30分钟之间的时间而灭活，例如暴露于90℃10分钟，暴露于90℃3分钟，暴露于90℃1分钟，暴露于120℃3分钟，或暴露于120℃1分钟。灭活步骤的温度和持续时间使非报道激酶变性，而保留报道激酶的活性基本上完好无损。在另一个实施方案中，利用化学变性处理去除/灭活非报道激酶。适当的处理的实例包括暴露于离液剂(chaotrope)，如尿素(例如，浓度大于2M的尿素)或胍(例如，浓度大于1M的胍)，暴露于去污剂(例如，大于0.5％的SDS，肌氨酰或tritonX-100)，暴露于自由基产生剂(例如，＞1000ppm的来源于次氯酸钠或等价试剂的活性氯)或暴露于氧化处理。在另一个实施方案中，利用酶变性处理去除/灭活非报道激酶。适当的酶的实例包括高度加工蛋白酶，诸如例如，蛋白酶-K，和嗜热菌蛋白酶(thermolysin)。在另一个实施方案中，通过暴露于所选的pH(例如，低于pH4，或大于pH11，使用诸如50mMCAPSpH11的缓冲液)、所选的盐浓度(例如，＞2M硫酸铵)、EDTA或其组合而去除/灭活非报道激酶。在另一个实施方案中，通过加入选择性或特异性抑制非报道激酶的抑制剂(即，所述抑制剂灭活所述非报道激酶，而保留报道激酶的活性基本上完好无损)而去除/灭活非报道激酶。适当的抑制剂的实例包括：星形孢菌素(staurosporine)；钒酸盐(vanadate)(例如，原钒酸盐(orthovanadate)或十钒酸盐(decavanadate))；甘油磷酸酯(glycerophosphate)；二腺苷磷酸(Diadenosinephosphates)，诸如Ap6A(二腺苷六磷酸(Diadenosinehexaphosphate))，Ap5A(二腺苷五磷酸(Diadenosinepentaphosphate))，Ap4A(二腺苷四磷酸(Diadenosinetetraphosphate))，和/或Ap3A(二腺苷三磷酸(Diadenosinetriphosphate))；维生素C；AMP-PCP；AMP-PNP；AMP-S；ATP-γS；和Ara-ATP。优选非报道激酶的竞争性抑制剂(例如，非报道腺苷酸激酶的竞争性抑制剂)(例如，二腺苷磷酸抑制剂，诸如Ap4A和/或Ap5A)。在一个实施方案中，所述抑制剂选择性或特异性抑制哺乳动物和真菌(例如，酵母)和植物非报道激酶。在另一个实施方案中，所述抑制剂(例如，Ap5A)选择性或特异性抑制哺乳动物和真菌(例如，酵母)非报道激酶。在另一个实施方案中，所述抑制剂(例如，Ap4A和/或Ap6A)选择性或特异性抑制哺乳动物非报道激酶。抑制剂可以凭经验确定，例如，用于不同的样品或基质。例如，实验上已经表明一定范围的不同的抑制剂提供对报道激酶(例如，来自嗜酸热硫化叶菌(S.acidocaldarius)，海栖热袍菌(T.maritima)本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．用于检测报道激酶活性的测定法，其包括：（ｉ）将所述报道激酶添加到测定混合物中，其中所述报道激酶与ＡＤＰ接触，并且在与ＡＤＰ接触后不超过５分钟，所述报道激酶与生物发光试剂接触，其中，在所述报道激酶与ＡＤＰ接触之前，所述测定混合物基本上不含非报道激酶（即，除报道激酶之外的激酶）；和（ｉｉ）检测来自所述测定混合物的光输出。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】GB0900151.22009年1月7日1.用于检测外源激酶活性的测定法，其包括：(i)将所述外源激酶添加到测定混合物中，其中所述外源激酶同时与ADP接触和生物发光试剂接触，其中，在所述外源激酶与ADP接触之前，所述测定混合物基本上不含除外源激酶之外的激酶；和(ii)检测来自所述测定混合物的光输出，其中所述生物发光试剂包括荧光素和荧光素酶，其中所述外源激酶选自腺苷酸激酶或丙酮酸激酶。2.按照权利要求1所述的测定法，其中，在所述外源激酶与ADP接触之前，所述测定混合物基本上不含ATP。3.按照任一前述权利要求所述的测定法，其中，在所述外源激酶与ADP接触之前，除外源激酶之外的激酶基本上被去除或灭活。4.按照权利要求1-2任一项所述的测定法，其中，在所述外源激酶与ADP接触之前，ATP基本上被去除。5.按照权利要求1-2任一项所述的测定法，其中所述外源激酶是腺苷酸激酶。6.按照权利要求1-2任一项所述的测定法，其中所述外源激酶是三聚体或单体腺苷酸激酶。7.按照权利要求1-2任一项所述的测定法，其中所述外源激酶是热稳定激酶。8.ADP和生物发光试剂的混合物和外源激酶在制备用于确定样品中分析物的存在的试剂盒中的用途，其中：(i)将所述样品暴露于所述外源激酶，所述外源激酶偶联到对所述分析物特异性的结合剂，从而当在样品中存在所述分析物时，在所述外源激酶和所述分析物之间形成复合物；(ii)将复合的外源激酶与未复合的外源激酶分离；和(iii)使用按照权利要求1-7任一项所述的测定法，测量所述复合的外源激酶的活性。9.ADP和生物发光试剂的混合物和外源激酶在制备用于确定样品中分析物的存在的试剂盒中的用途，其中：(i)提供包含所述外源激酶的固体支持物，其中所述外源激酶通过接头附着到所述固体支持物上，所述接头包括对所述分析物特异性的结合剂；(ii)将所述样品施加到所述固体支持物上，由此当在所述样品中存在所述分析物时，所述分析物将外源激酶从所述固体支持物上置换下来；和(iii)使用按照权利要求1-7任一项所述的测定法，测量所述被置换下来的外源激酶的活性。10.ADP和生物发光试剂的混合物和外源激酶在制备用于检测样品中分析物的存在的试剂盒中的用途，其中：(i)提供固体支持物，其上附着对所述分析物特异性的第一结合剂；(ii)将所述固体支持物暴露于所述样品，从而当在所述样品中存在所述分析物时，所述分析物通过所述第一结合剂附着到所述固体支持物上；(iii)将所述固体支持物暴露于所述外源激酶，所述外源激酶偶联到对所述分析物特异性的第二结合剂，从而所述外源激酶通过所述第二结合剂和已经结合的分析物之间的相互作用附着到所述固体支持物上；(iv)将在步骤(iii)中获得的混合物施加到滤膜上，其中所述固体支持物保留在所...

【专利技术属性】
技术研发人员：马克·J·萨顿，
申请(专利权)人：健康保护局，
类型：发明
国别省市：GB