一种中药注射剂致敏原的综合检测方法技术

本发明专利技术涉及免疫学与中药学领域，公开了一种中药注射剂致敏原的综合检测方法。本发明专利技术是基于ELISA原理与指纹图谱差异性分析相结合技术，利用固相载体包埋抗原、IgE抗体或抗IgE抗体的免疫反应，分别采用中药注射剂成分抗原与标记抗IgE抗体、包埋IgE抗体与标记抗原、包埋IgE抗体与已知合成抗原，再与酶标抗体、包埋抗IgE抗体捕获血样中IgE抗体，再与标记抗原或抗原与标记抗体等形式的标记免疫反应；捕获IgE抗体对中药注射剂GC/MS、HPLC/MS指纹图谱差异分析，综合多方面信息来确定中药注射剂致敏的人与动物血样中的特异IgE及对应的致敏原。本发明专利技术所述中药注射剂的检测方法具有高特异性、高灵敏度和高效性，操作简单方便的特点，适用于多成分的同时检测，可有效防治漏查。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及免疫学与中药学领域，具体涉及一种中药注射剂致敏原的快速检测方法。
技术介绍
中药注射剂系我国特有的现代化中药新剂型，在我国临床上已大量使用。随着中药注射剂临床应用的日益广泛，有关中药注射剂不良反应(ADR)及致死亡病例报道日益增多，过敏反应均为常见的不良反应之一。中药注射剂引起的过敏反应主要分为I型(速发型)、II型(细胞毒型)、III型 (免疫复合物型)、IV型(迟发型)过敏反应。其中，由IgE介导的I型过敏反应是中药注射剂在临床上最常引起的一类过敏反应，其发病急，可迅速出现皮肤潮红、瘙痒、腹痛甚至过敏性休克等严重症状。I型超敏反应是致敏原刺激抗体的淋巴结、肝、脾等器官的单核吞噬系统，触发浆细胞反应产生特异性IgE(SlgE)抗体。IgE分子的Fc端附着在肥大细胞或嗜碱性粒细胞的IgE受体上，使机体处于致敏状态。当机体再受同类型致敏原刺激时，致敏原与IgE分子交联，引起肥大细胞或嗜碱性粒细胞脱颗粒化，释放出组胺、白三烯及细胞因子等化学物质产生过敏反应、导致机体的毛细血管扩张、水肿、平滑肌痉挛、内分泌活动亢进，引发过敏性疾病的临床症状，严重时可产生过敏性休克等危及生命。由于中药注射剂成分复杂，也并不是所有的成分能致敏，而是一部分能与体内蛋白自动结合的成分，可以与血液中蛋白结合，也可能与组织中蛋白结合而致敏，并且中药注射剂的原成分与代谢成分都可能是致敏性成分。目前的致敏原检测方法主要有皮肤主动过敏试验、全身主动过敏试验、皮肤被动过敏试验、小鼠耳廓肿胀试验(MEST)、啮齿类局部淋巴结实验(LLNA)、Buehler分析法、豚鼠最大值法(GPMT)等，但是这些检测方法仅适用于单成分制剂。怎样确定其中的致敏性成分和测定与其对应的特异性IgE含量方法对于安全使用中药注射剂是大家公认的国际性难题。目前有人提出将中药注射剂的成分分离并固定，然后再与所产生的抗体酶联免疫反应进行判断，一则小分子的半抗原不好固定，在进行固相酶联免疫吸附法时会被洗脱液洗掉的，故难实现目标；同时中药注射剂致敏原除了与血液中的IgE反应外，还与其它的 IgG, IgA, IgM, IgD反应，而后四者并非致敏性免疫球蛋白，因此会受其它的干扰。现又改成单个成分逐个分析法，旨在将中药注射剂中单个成分分离，然后按单成分的模式逐个来试，这对于中药注射剂致敏性动物实验是允许的，但无法进行中药注射剂对人体致敏原研究，因为中药注射剂是整体而不加佐剂使用的，不能将成分折分或加入免疫增强剂来进行研究，这样的实验结果与中药注射剂临床使用的真实情况不一致，因此该法也行不通。另外，如果是中药注射代谢产物产生致敏，现有方法无法进行确定，且对于含量少的成分也可能存在漏查。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种中药注射剂致敏原的快速综合检测方法， 本专利技术所述检测方法具有高特异性，适用于多成分的同时检测，能够准确检测出中药注射剂中的致敏原成分，也可最大限度地防止漏查。本专利技术的基本思路采用已知成分抗原或抗体去套未知的致敏性多克隆特异性抗体IgE，具体就是1)宏观上仍采用酶联免疫吸附反应，中药注射剂致敏是I型超敏反应，标志性指标为免疫球蛋白IgE增加。2)在采用本法时，要用已知的抗体(抗原)去套人或动物按注射剂使用时所产生的 IgE。3)对于代谢产物或含量少的成分或可能漏查成分采用IgE与吸附中药注射剂指纹图谱弥补；4)对于与组织内的蛋白结合只能采用药物的半抗原决定簇，通过交叉反应弥补；5)多成分采用芯片同时测定；本专利技术是基于ELISA原理与指纹图谱差异性分析相结合技术，利用固相载体包埋抗原、IgE抗体、抗IgE抗体，分别采用中药注射剂成分抗原与标记好的抗IgE抗体间接酶联免疫反应、包埋的IgE抗体与血样中特异性的IgE竞争抗原的酶联免疫反应、包埋的抗IgE 抗体捕获血样中IgE抗体，再与标记的抗原，或抗原与标记抗体的酶联免疫反应、抗IgE抗体捕获血样中IgE抗体，再结合中药注射剂成分，采用GC/MS、HPLC/MS分析其指纹图谱差异来确定中药注射剂(拟)使用者血样中的特异IgE。总体方法是用针对动物实验的抗原抗体去套人或动物使用中药注射剂剂致敏所产生的特异性抗体IgE及成分。或采用HPLC/MS、 GC/MS来分析特异性抗体IgE所作用的特异性成分，诸法联合确定中药注射剂剂致敏原。首先将中药注射剂的成分尽可能分离出来，本专利技术可采用本领域技术人员熟知的分离方法，如溶剂、水蒸气蒸馏、升化、分子蒸馏、膜分离、超临界流体萃取、逆流液滴分配及各种层析法等，对中药注射剂中各组分进行分离。中药注射剂中大分子可直接作为全抗原，大部分为小分子化学物质，属于半抗原， 故需要用化学合成的方法，将分离的各组分修饰为全抗原。根据分离的各组分的具体结构采用化学方法与丙种球蛋，人血清白蛋白、牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、 血蓝蛋白以及人、牛和鸡Y-球蛋白、卵黄蛋白或人工合成的多聚赖氨酸、多聚谷氨酸、多聚混合氨基酸等合成抗原；或分别注射到动物体内或混合在一起注射到动物体内等偶联得到抗原，或用聚乙烯吡咯酮、羧甲基纤维素、聚甲基丙酸酯微粒联接得抗原。其中，对于含氨基的化学组分，可采用重氮化法、戊二醛法、多元酸酐法、二异氰酸酯法、偶氮苯甲酸法、亚胺酸酯法来合成；对于含糖基的化学组分，可以采用碘酸盐氧化法来合成；对于含羧基的化学组分，可以采用混合酸酐法、碳二亚胺法、活泼酯法来合成；对于含酮基的化学组分，可以采用O-羧甲基羟胺法、对-胼基苯甲酸法、Marmich反应法来合成；对于羧酸甲酯衍生物，可以采用叠氮化法来合成；对于含羟基的化学组分，可以采用氯乙酸钠法、三氯三嗪试剂法来合成；对于含氨基、羟基、巯基的化学组分，可以采用卤代硝基苯法、苯醌法来合成。在中药注射剂的成分的全抗原合成时，载体蛋白的选择优选与注射剂使用情况尽5可能一致，如中药注射剂用于人，载体蛋白为人的血清蛋白；如为动物，则为动物的血清蛋白，这样合成的抗原在动物体内产生的已知抗体与使用者体内产生的抗体决定簇尽可能相似，注入动物得到抗体，可能是IgG、IgA、IgD、IgM、IgE，以IgE最好，分离出各抗原的特异性抗体。本专利技术既先分离中药注射剂中各成分，制成全抗原，注入动物体内产生抗体，分离出抗体；又同时对人或动物的血清中IgE进行分离，注入动物体内产生二抗，标记抗IgE抗体，采用间接酶联免疫与已知抗原、标记抗体敏联免疫反应来筛查中药注射剂中的致敏性成分，或对已捕获的IgE抗体与中药注射剂成分抗原抗体反应，或对已捕获的IgE抗体与中药注射剂指纹图谱分析方法，根据特征峰的缺失来确定致敏性成分。本专利技术所述中药注射剂致敏原的检测方法适用于所有中药注射剂，如双黄连注射液、鹿茸精注射液、去感热注射液、肿节风注射液、茵桅黄注射液、茶色素注射液、鸦胆子油乳注射液、复方苦参注射液、健骨注射液、勒马回注射液、生脉注射液、消痔灵注射液、华蟾素注射液、清开灵注射液、乌头注射液、正清风痛宁注射液、白花蛇舌草注射液、伊痛舒注射液、补骨脂注射液、鱼金注射液、鱼腥草注射液、冠心宁注射液、穿山龙注射液、香丹注射液、 柴胡注射液、清热解毒注射液、雪莲注射液、黄芪注射液、醒脑静注射液、蟾蜍注射液、肝炎灵注射液、刺五加注射液、参附注射液、参麦注本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种中药注射剂致敏原的综合检测方法，其特征在于，包括：（１）分离中药注射剂的成分，将各成分或各成分合成全抗原所产生的特异性抗体ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ按一定规律包埋抗原或抗体成底芯片点阵，与经中药注射剂致敏的人或动物中的特异性ＩｇＥ结合，再与标记好的抗人或抗动物ＩｇＥ抗体显色，根据显色强、弱、有、无，由底芯片成分判断中药注射剂对人或动物致敏成分及ＩｇＥ；（２）包埋抗ＩｇＥ抗体制成底芯片，捕获拟用或使用过中药注射剂的人或动物血液中的ＩｇＥ，再与由中药注射剂已知结构成分抗原的标记物盖芯片，或与由中药注射剂已知结构成分作抗原，注射到动物体内产生特异性抗体ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ，的标记物有规律排列构成的盖芯片反应，根据显色强、弱、有、无，由盖芯片成分判断中药注射剂对人或动物致敏成分及ＩｇＥ；（３）包埋抗ＩｇＥ抗体，捕获拟用或使用过中药注射剂的人或动物血液中的ＩｇＥ，再与中药注射剂液、含药血清反应，采用ＨＰＬＣ、ＨＰＬＣ／ＭＳ、ＧＣ／ＭＳ测定，比较反应前后相应指纹图谱的差异确定中药注射剂对人或动物致敏成分及ＩｇＥ；（４）综合上述分析，最终确定中药注射剂对人或动物产生致敏的成分及特异性的ＩｇＥ。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：贺福元，邓凯文，邱云，陈锋，唐昱，曾姣丽，刘文龙，石继连，戴儒文，
申请(专利权)人：湖南中医药大学，
类型：发明
国别省市：43