汉赛巴尔通体的PCR鉴定方法技术

本发明专利技术提供一种汉赛巴尔通体的PCR鉴定方法，其根据汉赛巴尔通体外膜蛋白基因BH13010的序列高变区设计特异性引物，以待测样品DNA或细菌培养物为模板进行特异性扩增，若能扩增到特异性条带，即鉴定为汉赛巴尔通体。其中，所述的引物序列如SEQ?IDNo.6和7所示。本发明专利技术引物特异性好，鉴定方法准确度高，操作简单，对仪器设备要求低，成本低。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物检测技术，具体地说涉及汉赛巴尔通体的PCR鉴定方法。
技术介绍
汉赛巴尔通体(Bartonellahenselae)是引起猫抓病(Cat-Scratch Disease, CSD)的主要病原菌。此病常见(主要临床表现是淋巴结炎)于儿童，发病平均年龄为14 岁，高发年龄在10岁以内。多数患者表现为被猫抓(或咬)伤后，在伤口处出现红斑丘疹或脓疱。局部淋巴结红肿、发热，可触动、较硬，30%自发性化脓，以头面部、上肢和腹股沟淋巴结居多。病人还可伴有全身不适、发热、咳嗽等症状。汉赛巴尔通体还会引起人心内膜炎、 帕里诺眼-腺综合征(Parinaud，s oculoglandular syndrome, POGS)、脑炎、脊髓炎、周围神经病、单侧或双侧视网膜炎、肝脾肉芽肿、骨髓炎和胸膜炎等疾病。猫、狗是此菌的主要宿主，可以通过抓、咬等密切接触将汉赛巴尔通体传播给人类。汉赛巴尔通体的检测鉴定方法有核酸分析、探针杂交、荧光定量PCR和特异性抗体检测鉴定。目前，主要依靠PCR方法扩增目标基因后测序进行核酸序列分析。探针杂交方法以往有些研究者应用，但是由于操作繁琐及方法的特异性低等问题，已较少有人应用。 特异性抗体检测鉴定的方法虽然有人报道应用，但是与其他细菌及巴尔通体交叉反应问题仍然存在。核酸序列分析方法虽然能够提供确切的鉴定结果区分巴尔通体的种别，但是此方法需要将目标基因的扩增产物测序、然后进行序列比对以及构建进化树，分析过程繁琐， 不仅仪器化程度要求较高，对操作人员的专业要求也较高，而且耗时、费用较高，仅能在专业实验室进行，不利于推广应用。在少数专业实验室应用的荧光定量PCR方法也存在上述同样的问题，而且检测的准确性仍需要大量的实验研究证实。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供汉赛巴尔通体的鉴定方法及其鉴定用引物。本专利技术首先提供一种汉赛巴尔通体的PCR鉴定方法，其根据汉赛巴尔通体外膜蛋白基因BH13010的序列高变区设计特异性引物，以待测样品DNA或细菌培养物为模板进行特异性扩增，若能扩增到特异性条带，即鉴定为汉赛巴尔通体。本专利技术通过RAPD-PCR的方法，从汉赛巴尔通体的基因组中筛选出dnaG (引发酶基因)、BHl 1550(膜整合蛋白基因)、ppdK (丙酮酸磷酸双激酶基因)、BH13010 (外膜蛋白基因)、nrdl (核糖核苷酸还原酶基因)、rpsK (核糖体蛋白基因)、IpxD (酰基转移酶基因)。 再对这些基因片段进行特异性筛选，发现BH13010特异性地仅存在汉赛巴尔通体和五日热巴尔通体基因组中，利用序列高变区可特异性的鉴定汉赛巴尔通体，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1 所示。根据上述结果，本领域技术人员应当理解，所述的序列高变区是指与五日热巴尔通体相比，汉赛巴尔通体序列特异性较强的区域。其中，引物序列为Cpf GTGACAGCTTATGGCGGTTT,Cpr :CGTCCATTGACCAATTTCC。本专利技术还提供一种汉赛巴尔通体的多重PCR鉴定方法，以待测样品DNA或细菌培养物为模板，特异性地扩增汉赛巴尔通体的dnaG基因、膜整合蛋白基因BH11550、外膜蛋白基因BH13010和IxpD基因，扩增到目的条带即为汉赛巴尔通体，其中，外膜蛋白基因 BH13010的引物是根据汉赛巴尔通体外膜蛋白基因BH13010的序列高变区设计的。其中，扩增引物分别为BhAF:CACGCGCATCAAGATAACGAC(SEQ ID No. 4)，BhAR :TTCAATCCAATCGCCGACA(SEQ ID No. 5)；Cpf GTGACAGCTTATGGCGGTTT(SEQ ID No. 6)，Cpr :CGTCCATTGACCAATTTCC(SEQ ID No. 7)；禾口6fl =ACAGCAGTAGTATGCAAtAA(SEQ ID No. 8),6f2 :ACGTCCACACCACAGCG(SEQ ID No. 9)。用上述引物进行多重PCR的判断标准为是否扩增出三条特异性条带，其中片段大小分别为约1171bp、293bp和215bp。其中，PCR反应液中，引物BhAF、BhAR, Cpf和Cpr的浓度分别为0. 2 μ Μ，引物6Π 和6f2的浓度为0. 3 μ M。其中多重PCR反应条件为94°C变性30sJ4 58°C退火30s，72°C延伸lmin，扩增 25个循环。本专利技术还提供如前所述的汉赛巴尔通体PCR鉴定用引物或多重PCR鉴定用引物以及含有该引物的鉴定用试剂盒。本专利技术还提供汉赛巴尔通体PCR鉴定用引物或多重PCR鉴定用引物还可用于制备鉴定汉赛巴尔通体的试剂。本专利技术以dnaG、BH11550 (膜整合蛋白基因)、BH13010 (膜蛋白基因)、IpxD基因为扩增目标，设计针对汉赛巴尔通体菌株的PCR引物，进行多重PCR扩增。通过优化反应体系、扩增参数，能够准确、灵敏地检测单个菌落鉴定出汉赛巴尔通体。上述基因中dnaG、 BH11550(膜整合蛋白基因)和IpxD基因的核苷酸序列具有巴尔通体属特异性，即可以在属水平区别巴尔通体与其他菌；BH13010(膜蛋白基因)是汉赛巴尔通体和五日热巴尔通体特有基因，在序列高变区设计引物可以在种水平上区别五日热巴尔通体和其他巴尔通体；上述基因联合应用时增加鉴定方法的特异性，保证了汉赛巴尔通体鉴定的准确性。附图说明图 1RAPD-PCR 电泳图。图2单个菌落为模板的多重PCR反应电泳图。F, QIAGEN Fast Cycling PCR Kit 反应体系；T，TaKaRa Ex Taq反应体系；S，赛百盛Taq DNA聚合酶反应体系；M，IOObp DNA ladder marker ；N，空白对照；h，试剂盒提取汉赛巴尔通体DNA模板；Ch，汉赛巴尔通体单个菌落模板；Cg，格拉汉姆巴尔通体单个菌落模板。图3PCR反应的特异性检测电泳图。M，IOObp DNA ladder marker ;N，空白对照； h，汉赛巴尔通体；q，五日热巴尔通体；C，克氏巴尔通体；k，克勒巴尔通体；vb，文森巴尔通体博格霍夫亚种；va，文森巴尔通体阿鲁潘亚种；e，伊丽莎白巴尔通体；g，格拉汉姆巴尔通体；t，特利波契巴尔通体；d，道志巴尔通体；b，杆菌样巴尔通体。图4其他革兰阳性、阴性菌及动物模板为模板的PCR反应的特异性检测电泳图。 M, IOObp DNA ladder marker ;1，12，空白对照；2，13，汉赛巴尔通体；3，莫氏立克次体；4， 恙虫病东方体；5，嗜吞噬细胞无形体；6，日本立克次体；7，普氏立克次体；8，金黄色葡萄球菌；9，结核分枝杆菌；10，鼠疫耶尔森菌(疫苗株)；11，钩端螺旋体；14，伯氏疏螺旋体；15， 鲍曼不动杆菌；16，根癌土壤杆菌；17，猪种布鲁菌；18，羊种布鲁菌；19，大肠杆菌；20，志贺菌；21，幽门螺杆菌；22，空肠弯曲菌；23，霍乱弧菌；24，伤寒杆菌；25，鼠伤寒沙门菌；26， 副流感嗜血杆菌；27，军团菌；28，脑膜炎奈瑟菌C群；29，脑膜炎奈瑟菌A群；30，肺炎链球菌；31，肺炎克雷伯菌；32，人 DNA ；33 JgDNA ；34，犬 DNA ；35，鼠 DNA。具体实施例方式以本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种汉赛巴尔通体的ＰＣＲ鉴定方法，其特征在于，根据汉赛巴尔通体外膜蛋白基因ＢＨ１３０１０的序列高变区设计特异性引物，以待测样品ＤＮＡ或细菌培养物为模板进行特异性扩增，若能扩增到特异性条带，即鉴定为汉赛巴尔通体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：栗冬梅，刘起勇，张建中，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，
类型：发明
国别省市：11