一种骆驼蓬脂转移蛋白及其制备方法和应用技术

骆驼蓬脂转移蛋白PHP，本发明专利技术涉及一种具有抗真菌、抑癌及抗病毒活性的新型蛋白质的制备和应用。以植物中药骆驼蓬种子为原料，制备工艺步骤为：粗品制备、阳离子交换层析分离和分子筛纯化。经逐步分离收集具抗菌活性的纯化组分，透析除盐，冷冻干燥即得到纯化的PHP。本发明专利技术采用滤纸片琼脂扩散法，研究证明该蛋白对交格链孢菌、指状青霉菌、根霉病菌、稻瘟病菌和意大利青霉菌等五种植物病原真菌生长有抑制作用。采用MTT法证明该蛋白对人食管癌细胞Eca109、人宫颈癌细胞HeLa、人胃癌细胞MGC-7和鼠黑色素瘤细胞B16等的增殖具有抑制作用。该蛋白能够抑制HIV-1反转录酶活性。这一蛋白对开发出抗农业病原真菌和抗肿瘤抗病毒药物是有用的。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及一种从骆驼蓬种子中分离纯化出的分子量为 16kDa的脂转移蛋白PHP，更具体地，本专利技术涉及一种具有抗真菌、抑制肿瘤活性及抑制 HIV-I反转录酶活性的骆驼蓬脂转移蛋白，以及利用骆驼蓬种子为原料进行粗品制备、阳离子交换层析分离和分子筛纯化制备所述蛋白质的方法，和所述蛋白质的应用。
技术介绍
植物生长常会受到各种真菌的侵袭，在长期进化过程中，植物体形成了一套天然防御体系来与外源侵袭物对抗。植物抗真菌蛋白(antifungal protein,AFP)就是其中的一类，它们可抑制真菌生长或杀死真菌。根据植物抗真菌蛋白的作用机制、结构和序列特性， 可将其大体分为以下几类病程相关蛋白(pathogenesis-related proteins，PRs)、防御素 (defensins)、类亲环素蛋白(cyclophilin-like proteins)、核糖体失活蛋白(ribosome inactivating Protein, RIPs)、脂转移蛋白(lipid transfer proteins, LTPs)、蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)、2S清蛋白类(2S albumin proteins)及其他蛋白。脂转移蛋白(lipid transfer protein, LTP)是一类分子量相对较小的碱性蛋白质，由于能够转移磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇和磷脂酰丝氨酸，并能够促进线粒体和微体之间的磷脂交换而得名(Gincel.E，etal. 1994)，在动物、植物、酵母、真菌和一些细菌中均有发现。在植物中至今只发现有非特异性脂转移蛋白(non-specific lipid transfer protein，nsLTP)，其脂转移活性具有广泛性和不确定性。现在已从多种植物中分离得到nsLTPs，如玉米、水稻、大麦、谷子、洋葱、豇豆、白菜、菠菜、甜桔、萝卜、桃、拟南芥等许多不同植物组织中发现。并已对来自水稻、玉米、桃等植物中的nsLIPs的分子结构进行了解析。在植物中非特异脂转移蛋白均为可溶性蛋白，含量丰富，可以达到可溶蛋白总量的4%。据报道，植物的许多器官都有LTP的分布，如种子、茎、叶、根、十字花科的果实以及花器官，而且发现在围绕植物器官的表皮细胞和外周细胞、细胞壁和表皮组织角质层中的含量特别高(Trends Microbiol, etal. 1995)。最初对植物非特性脂转移蛋白的研究主要集中在生物膜之间脂类物质的转运。随着不断的深入研究，发现nsLTP蛋白在植物抗病虫害、抗肿瘤及抗病毒等方面也具有非常重要的作用。近年来，从传统中草药中继续挖掘新的活性蛋白质成分，以期找到一些在农业和医药上具有应用价值的蛋白质或多肽，已经成为科研工作者的一个重要的研究方向。骆驼蓬(Peganum harmala L.)是蒺藜科(Zygophyllaceae)骆驼蓬属(Peganum) 多年生草本植物。多生于干旱草地、盐碱化荒漠地带。分布于内蒙古、河北、山西、陕西、宁夏、甘肃、青海、新疆等省区；蒙古、苏联也有分布。作为维吾尔传统药材已有很久的使用历史，其种子或全草可用于治疗咳嗽气喘、风湿痹痛和无名肿痛等病症。骆驼蓬中生物碱等化学成分具有抗菌、杀虫和抗肿瘤等活性，但同时对机体有一些神经毒副作用。本专利技术首次从骆驼蓬种子中分离纯化出一种分子量为16kDa的脂转移蛋白PHP，具有抗真菌和抗肿瘤活性及抑制HIV-I反转录酶活性的作用，未见现有文献报道。本专利技术为科学认识骆驼蓬中活性蛋白的功能提供依据，在植物基因工程、农业抗真菌病原病制剂和抗癌蛋白药物的筛选方面具有重要的理论和应用价值。
技术实现思路
本专利技术提供一种骆驼蓬脂转移蛋白PHP，其N端含有SEQID NO :1所示的氨基酸序列ITCPQVTQSLAPCVPHJSG，通过N端氨基酸残基的同源性比较，说明是一种新的脂转移蛋白。所述蛋白来源于药用植物骆驼蓬(Peganum harmala L.)种子，是在天然状态下为两个亚基组成的同源二聚体，分子量为16kDa，单一亚基的分子量约为8kDa，该蛋白是一种等电点pi为8. 4的碱性蛋白质。本专利技术首次进行了骆驼蓬脂转移蛋白的分离纯化，以骆驼蓬种子为原料，通过硫酸铵分级沉淀，阳离子交换层析及凝胶过滤分子筛层析，得到了一种骆驼蓬脂转移蛋白PHP。对该蛋白进行了抗真菌、抗肿瘤活性和抑制HIV-I反转录酶活性及应用分析。一种骆驼蓬脂转移蛋白及其制备方法和应用，包括以下步骤(1)粗品制备以骆驼蓬种子为材料，将其粉碎后，加入pH为7. 0-7. 5的中性至弱碱性条件的PBS磷酸缓冲液，低温搅拌抽提下过夜，低温离心后收集上清液，在上清液中缓慢加入硫酸铵调至饱和度为30% -50%之间，低温静置4h，离心收集上清液，弃沉淀。继续在上清液中缓慢加入硫酸铵调至饱和度为60% -80%之间，再次低温静置4h后，离心收集沉淀，并溶于少量磷酸缓冲液中，透析除盐，冷冻干燥得蛋白粗品；(2)阳离子交换层析分离纯化采用Resource S或与其性质相当的阳离子交换柱，对上述步骤(1)得到的粗品蛋白进行层析，上样后用适当浓度为0. 02-0. 05mol/L的PBS 磷酸缓冲液先洗去未结合的蛋白，再用含0. 1-lmol/L NaCl的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱， 检测活性后收集具有抗菌和抗肿瘤活性的组分，用磷酸盐缓冲液充分透析后保存备用；(3)分子筛纯化将上述步骤(2)得到的样品上Superdex 75型分子筛柱，用含有一定浓度NaCl的浓度为0. 02-0. 05mol/L的PBS磷酸缓冲液洗脱，分步收集，检测活性后收集具有抗菌和抗肿瘤活性的组分，透析除盐，冷冻干燥即得到纯化的骆驼蓬脂转移蛋白PHP 纯品。(4)上述步骤( 得到的纯化的骆驼蓬脂转移蛋白PHP具有抗真菌、抑制肿瘤活性及抑制HIV-I反转录酶活性，在抗农业病原真菌及在肿瘤和抗病毒的蛋白药物治疗方面具有良好的应用前景。这里需要指出的是，本专利技术给出的天然来源的PHP蛋白的制备方案不是获得天然 PHP的唯一方案。在发现骆驼蓬蛋白粗提液具有抑制真菌和肿瘤生长的前提下，用各种蛋白纯化方法来分离纯化骆驼蓬天然脂转移蛋白，例如将硫酸铵分级沉淀、阳离子或阴离子交换、反相层析和分子筛法应用于本专利技术方案各步骤的组合、增减或替换，可以将目的蛋白分离纯化，得到纯化的骆驼蓬脂转移蛋白PHP。本专利技术得到的新的骆驼蓬脂转移蛋白PHP具有明显的抗真菌活性，对能引起水果腐烂和粮食霉变的5种植物病原真菌，如交格链孢菌(Alternaria alternate)、指状青霉菌(Penicillium degitatum)、根霉病菌(Rhizopus stuolonifer)、禾S癌病菌(Magnaporthe grisea)和意大利青霉菌(Penicillium i tali cum)等均有生长抑制作用，其中对交格链孢菌有很强的抑制能力，所述蛋白可以用于制备食品果蔬防腐剂和抗农业病原真菌的生物农药制剂。本专利技术得到的新的骆驼蓬脂转移蛋白PHP还具有明显的抗癌活性，对人宫颈癌 HeLa、人胃癌MGC、人食管癌Eca-109和鼠黑色素瘤B16等肿瘤细胞均有显著的抑制生长作用，但对正常Vero细胞抑制作用较小本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种骆驼蓬脂转移蛋白ＰＨＰ，其特征在于：Ｎ端含有ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：１所示的氨基酸序列ＩＴＣＰＱＶＴＱＳＬＡＰＣＶＰＹＬＩＳＧ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙素荣，马晓瑾，刘东亮，吕慧，李阳，张富春，
申请(专利权)人：新疆大学，
类型：发明
国别省市：65