耐酸中温α-淀粉酶及其制备方法技术

本发明专利技术公开了耐酸中温α-淀粉酶及其制备方法，包括以下步骤：步骤A1，前体α-淀粉酶基因的扩增：步骤A2，前体α-淀粉酶的的定点突变；步骤A3，突变α-淀粉酶表达载体的构建；步骤A4，表达载体转化枯草芽孢杆菌。应用本发明专利技术获得的重组体菌株可以进行耐酸性α-淀粉酶突变体的工业化生产，在有选择压力的液体培养基中培养重组体细胞，无需经诱导表达，上清用硫酸铵沉淀，沉淀透析除盐之后加入丙烯葡聚糖凝胶S300凝胶柱，用洗脱液洗脱即可得到所需的耐酸α-淀粉酶突变体。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及耐酸中温α -淀粉酶及其制备方法，属于生物

技术介绍
α-淀粉酶(a-U-glucanhydrolase EC3. 2. 1. 1)，又称为液化型淀粉酶。它能从淀粉分子的内部任意切开α-1，4糖苷键，产生分子量较小的麦芽糊精、葡萄糖及其它低聚糖。淀粉在α-淀粉酶的作用下，分子迅速降解，粘度下降，即完成液化作用。在淀粉糖加工业、纺织工业、造纸工业、制药行业、酿酒行业及燃料乙醇生产中被广泛应用，具有相当大的商业价值。目前在工业生产中，α-淀粉酶一般以微生物发酵法进行大规模生产，这些微生物包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌等。近年来随着淀粉原料深加工工业的发展，酒精行业工艺条件的改变，要求酶制剂工业不断更新和完善酶的种类，以满足工业生产的要求。对于淀粉糖化工业，一般是采用双酶法进行液化、糖化，即先加α-淀粉酶液化，再加糖化酶来糖化产生葡萄糖。目前市售的淀粉酶最适PH为6. 0-7. 0，糖化酶的最适ρΗ为4. 5左右，两者的作用ρΗ值差异较大，而淀粉原料液的天然PH为4. 5-5. 0左右。传统工艺淀粉液化后需添加酸来降低ρΗ值后糖化酶才起作用，这样用酸碱反复调节原料液的ΡΗ，既增加工艺，又引入外源离子，加重了分离的负担。在酒精行业中，由于废水的回填，使得原料液的PH值降为4-5，也不适合α-淀粉酶的作用。而在我国传统白酒生产中，由于固态发酵不彻底，在酒糟中普遍含有10%以上的淀粉，但酒糟的PH很低，此酸性条件下的淀粉利用就需要开发适合该生产条件的酸性α -淀粉酶。此外，以淀粉质为原料的酒精发酵工业中，淀粉中低温液化工艺(75-85°C喷射中温 α -淀粉酶液化1-2小时，然后降温至60°C左右部分糖化后同步糖化发酵生产酒精)与传统的高温液化糖化(高温105°C喷射液化，95°C液化1-2小时，然后降温至60°C左右部分糖化后发酵)的工艺相比，具有节能省耗、可发酵性糖损失少的优点。由于耐酸性的α-淀粉酶能在酸性条件下保持高活性，不仅可以简化酿酒发酵工业的液化、糖化过程，降低淀粉深加工的生产成本，而且在消化类药物、酒精糟液利用、一步法生产糖浆等诸多方面显示出巨大的利用前景。随着我国淀粉糖、酿造及发酵工业的日益发展，对耐酸性淀粉水解酶的需求也将越来越大。为了适应整个淀粉糖化、食品、纺织、制药及酒精行业的需要，简化工艺，降低成本、省水节能，满足一些在酸性条件下进行淀粉原料液化工艺的要求，开发一种耐酸中温的 α-淀粉酶就势在必行。
技术实现思路
针对上述情况，本专利技术解决了现有α-淀粉酶耐酸性和温度适应性不能同时兼顾，以致应用受到限制的问题；采用重组DNA技术，提供了定点突变前体α -淀粉酶以改善其特性，得到了活力提高的耐酸耐温α-淀粉酶突变体及其制备方法。本专利技术从枯草芽孢杆菌中克隆前体α -淀粉酶基因，对其141及558位点的氨基酸残基进行突变，并在芽孢杆菌中高效表达α-淀粉酶突变体。从而为耐酸性α-淀粉酶的工业化生产提供一条可行途径。本专利技术将分离到的编码前体α -淀粉酶的基因的141及558位点的氨基酸残基进行突变，以改变其酸稳定性和酶活力。并构建重组表达载体，转化枯草芽孢杆菌宿主，高效表达了突变体 α -淀粉酶，突变酶具有良好的酸稳定性，有较宽的PH适用范围，更适于工业化应用。α -淀粉酶突变体，是突变α -淀粉酶编码DNA序列的表达产物。α -淀粉酶突变体具有的氨基酸序列是通过对SEQ ID Ν0:12所示的前体α-淀粉酶氨基酸序列中R141及 L558的氨基酸位点的替换而得到的。α -淀粉酶突变体的序列是在前体α -淀粉酶原有序列上发生了氨基酸替换。本专利技术涉及了两对完全互补的引物，用重组PCR方法将前体α-淀粉酶的141及558位的氨基酸进行突变(图1)，得到经过耐酸性改造的本专利技术突变体基因。 编码α-淀粉酶突变体的基因序列见SEQ ID NO :2。本专利技术的α-淀粉酶突变体ρΗ低于 5. 0时具有酸稳定性，且其活力提高为前体α -淀粉酶的3. 5倍。本专利技术所用的前体α -淀粉酶来源是枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌。耐酸α -淀粉酶，包括突变体α -淀粉酶DNA序列的重组表达载体重组表达载体除包括编码突变α -淀粉酶的DNA序列外，还具有表达该基因所需的调控元件。可供选择使用的在枯草芽孢杆菌中表达的质粒载体有很多。这些载体都带有完整的阅读框架，即含有一个启动子和终止子，或另外带有其它表达调控元件。优选的启动子是枯草芽孢杆菌中的 Ρ43启动子。在启动子和终止子之间有一段多克隆位点，这些多克隆位点分别包含有若干单一酶切位点，选用限制酶将载体切成线状，并用DNA连接酶将突变α-淀粉酶基因连接到所选载体上，从而构成一个在启动子和终止子之间含有目的基因的重组分泌型载体。本专利技术使用枯草芽孢杆菌表达载体PWB980，插入本专利技术的突变的α -淀粉酶DNA编码序列以后得到重组表达载体，它除了携带有所述的淀粉酶DNA编码序列外，还带有Ρ43启动子、sacB基因信号肽序列、卡那霉素抗性基因，以及为外源蛋白高效表达所需的调控元件。重组体细胞指的是包含编码本专利技术的α -淀粉酶的DNA的表达载体的适当宿主。 本专利技术所适用的宿主细胞包括任何可表达本专利技术的α-淀粉酶的可转化微生物，即枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌细胞，优选蛋白酶缺陷的枯草芽孢杆菌细胞。本专利技术包括产生α -淀粉酶突变体的方法，包括以下步骤通过定点突变技术，突变编码前体α -淀粉酶的DNA序列，得到编码α -淀粉酶突变体的DNA序列；将上述的突变DNA序列与载体相连接，得到携带α _淀粉酶突变体基因的重组表达载体；将重组表达载体转化宿主菌株，得到重组体细胞；将重组体进行发酵制备α-淀粉酶突变体。分离并纯化提取耐酸(ρΗ4. 0-6. 0)耐中温(65-75°C )的淀粉酶突变体。具体操作方法为耐酸中温α -淀粉酶的制备方法，包括以下步骤步骤Al，前体α-淀粉酶基因的扩增提取枯草芽孢杆菌染色体DNA，根据 Genbank中已报道的枯草芽孢杆菌淀粉酶基因为依据，设计如下引物上游引物Fl 5‘ -GCGCGAATTCGGAAACTGCAAACAAATCGAATGAGGTG-3‘ (SEQ ID NO 1)下游引物Rl :5，-CGCGAAGCTTATGCGGAAGATAACCATTCAAACCGG-3’ (SEQ ID NO 2)；PCR产物经纯化、双酶切后，连接到同样经双酶切线性化的pET_22b，转化大肠杆菌 JM109，得到 pET22-ACN7 ；步骤A2，前体α -淀粉酶的的定点突变设计含突变氨基酸残基的互补引物如下引物 1 :5，-TTGGTCGGACGGATGGGACATCACT-3，(SEQ ID NO 4)引物 2 :5，-AGTGATGTCCCATCCGTCCGACCAA-3，(SEQ ID NO 5)引物 3 :5，-GGGCCATAGAAGATACCGGATCATG-3，(SEQ ID NO 6)引物 4 :5，-CATGATCCGGTATCTTCTATGGCCC-3，(SEQ ID NO 7)以重组质粒PET22-ACN7为模板进行PCR扩增，按以下次序，将各成分在薄壁离心管内混合:PCR1 采用 5本文档来自技高网...

【技术保护点】
混合物转化枯草芽孢杆菌ＷＢ６００的感受态细胞，枯草芽孢杆菌转化子提取质粒，提取的质粒用限制性内切酶ＢａｍＨ　Ｉ和Ｓｐｈ　Ｉ进行酶切鉴定，测序，构建了枯草芽孢杆菌重组表达载体ｐＷＢ９８０－ＡＣＮ７－２。８０载体上：在１．５ｍＬ离心管中加入１２μＬ纯化的ＤＮＡ，４μＬ线性ｐＷＢ９８０载体，２μＬ　１０×连接酶ｂｕｆｆｅｒ，１μＬ　Ｔ４　ＤＮＡ连接酶，加水至总体积为２０μＬ，１６℃连接过夜；步骤Ａ４，表达载体转化枯草芽孢杆菌，将步骤Ａ３的连接聚合酶０．５μＬ．扩增条件为：９４℃２ｍｉｎ，１个循环；９４℃４０ｓ，５８℃，４０ｓ，７２℃，２ｍｉｎ，３０个循环；最后１个循环为７２℃１０ｍｉｎ；将所得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测、纯化、双酶切，然后连接到同样双酶切线性化的ｐＷＢ９扩增，按以下次序，将各成分在灭菌薄壁离心管内混合：采用５０μＬ扩增体系：ｄｄＨ２Ｏ　４１．５μＬ，１０×ｂｕｆｆｅｒ　５μＬ，ｄＮＴＰ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）１μＬ，上下游引物２（２０μｍｏｌ／Ｌ）各０．５μＬ，ＤＮＡ模板１μＬ，ＴａｑＤＮＡＣＡＡＡＴＣＧＡＡＴＧＡＧＧＴＧ－３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９）；下游引物Ｒ２：５’－ＣＧＣＧＧＣＡＴＧＣＡＴＧＣＧＧＡＡＧＡＴＡＡＣＣＡＴＴＣＡＡＡＣＣＧＧ－３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０）；以重组表达载体ｐＥＴＣＮ７－２为模板进行ＰＣＲ隆，经过测序验证，最终得到含有突变α－淀粉酶基因的重组表达载体ｐＥＴ－ＡＣＮ７－２；步骤Ａ３，突变α－淀粉酶表达载体的构建：枯草芽孢杆菌表达载体采用ｐＷＢ９８０，设计如下引物：上游引物Ｆ２：５’－ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＧＧＡＡＡＣＴＧＣＡＡＡＡ模板１μＬ，ｐｆｕ高保真ＤＮＡ聚合酶０．５μＬ．扩增条件为：９４℃２ｍｉｎ，１个循环；９４℃４０ｓ，６０℃，４０ｓ，７２℃，２ｍｉｎ，２０个循环；最后１个循环为７２℃７ｍｉｎ。ＰＣＲ产物经纯化、转化大肠杆菌ＸＬ－１０感受态细胞，挑选阳性克ｍｉｎ，２０个循环；最后１个循环为７２℃７ｍｉｎ。ＰＣＲ２：采用５０μＬ体系，ｄｄＨ２Ｏ３８．５Ｍｌ，１０×ｂｕｆｆｅｒ　５μＬ，ｄＮＴＰ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）２μＬ，引物３（２０μｍｏｌ／Ｌ）２μＬ，引物４（２０μｍｏｌ／Ｌ）２μＬ，ＤＮ，ｄＮＴＰ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）２μＬ，引物１（２０μｍｏｌ／Ｌ）２μＬ，引物２（２０μｍｏｌ／Ｌ）２μＬ，ＤＮＡ模板１μＬ，ｐｆｕ高保真ＤＮＡ聚合酶０．５μＬ。扩增条件为：９４℃２ｍｉｎ，１个循环；９４℃４０ｓ，６０℃，４０ｓ，７２℃，２ＣＣＧＧＴＡＴＣＴＴＣＴＡＴＧＧＣＣＣ－３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７）以重组质粒ｐＥＴ２２－ＡＣＮ７为模板进行ＰＣＲ扩增，按以下次序，将各成分在薄壁离心管内混合：ＰＣＲ１：采用５０μＬ体系，ｄｄＨ２Ｏ３８．５μＬ，１０×ｂｕｆｆｅｒ　５μＬＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４）引物２：５’－ＡＧＴＧＡＴＧＴＣＣＣＡＴＣＣＧＴＣＣＧＡＣＣＡＡ－３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５）引物３：５’－ＧＧＧＣＣＡＴＡＧＡＡＧＡＴＡＣＣＧＧＡＴＣＡＴＧ－３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６）引物４：５’－ＣＡＴＧＡＴ连接到同样经双酶切线性化的ｐＥＴ－２２ｂ，转化大肠杆菌ＪＭ１０９，得到ｐＥＴ２２－ＡＣＮ７；步骤Ａ２，前体α－淀粉酶的的定点突变：设计含突变氨基酸残基的互补引物如下：引物１：５’－ＴＴＧＧＴＣＧＧＡＣＧＧＡＴＧＧＧＡＣＡＴＣＡＣＴ－３’（ＳＧＡＡＡＣＴＧＣＡＡＡＣＡＡＡＴＣＧＡＡＴＧＡＧＧＴＧ－３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）下游引物Ｒ１：５’－ＣＧＣＧＡＡＧＣＴＴＡＴＧＣＧＧＡＡＧＡＴＡＡＣＣＡＴＴＣＡＡＡＣＣＧＧ－３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）；ＰＣＲ产物经纯化、双酶切后，１．耐酸中温α－淀粉酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤Ａ１，前体α－淀粉酶基因的扩增：提取枯草芽孢杆菌染色体ＤＮＡ，根据Ｇｅｎｂａｎｋ中已报道的枯草芽孢杆菌淀粉酶基因为依据，设计如下引物：上游引物Ｆ１：５’－ＧＣＧＣＧＡＡＴＴＣＧ...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王青艳，朱婧，黄日波，申乃坤，秦艳，谢能中，王成华，廖思明，黎贞崇，陈东，
申请(专利权)人：广西科学院，
类型：发明
国别省市：45