一种含凝血酶片段融合肽制造技术

本发明专利技术涉及新的凝血酶片段融合肽S-TP508，在TP508的N端加上了一段稳定肽(这段稳定肽主要由谷氨酰胺和精氨酸组成)。加入稳定肽的融合蛋白较之TP508延长了半衰期，克服了TP508易被酶解的弱点，提高了稳定性。本发明专利技术还涉及含有所述S-TP508的药物组合物，其可用于制备治疗皮肤组织损伤与角膜损伤的药物的用途。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及新的凝血酶片段融合肽S-TP508。本专利技术还涉及含有所述S-TP508的药物组合物。本专利技术还涉及所述S-TP508用于制备治疗皮肤组织损伤与角膜损伤药物的用途。本专利技术还涉及利用所述S-TP508治疗皮肤组织损伤与角膜损伤的疾病的方法。二.
技术介绍
凝血酶是由凝血酶原(Porthormbin)转化而来的一种丝氨酸蛋白酶，在体内的主要作用是催化纤维蛋白原转变成纤维蛋白，诱导血小板粘附、聚集和释放等反应，是血小板的强诱导剂，因而在血液凝固中起重要作用。现已证明，凝血酶除了其血液凝固作用外，还可刺激成纤维细胞、表皮细胞增生等，在促进创面愈合方面也起重要作用。TP508 (凝血酶受体激活肽)是取自人凝血酶原分子序列第508 530个氨基酸残基的片段，研究发现具有可特异性激活细胞表面的高亲合性凝血酶受体，刺激细胞分裂和趋化，参与组织修复，刺激细胞增生和促进创面愈合的功能。由于TP508是只有23个氨基酸组成的短肽(见序列为SEQ ID NO :1中12-34位氨基酸序列)，所以半衰期短，稳定性差。因而我们在TP508的N端加上了一段稳定肽(见序列为SEQID NO 1中1-11位氨基酸序列)，这段稳定肽主要由谷氨酰胺和精氨酸组成。 加入稳定肽的该融合蛋白较之TP508延长了半衰期，提高了稳定性。作为运用于人体的药物，克服了 TP508易被酸解的弱点，具有提高药效、降低病人服药量、延长有效期、减少成本等显著的社会和经济效益。TP508分子量非常小，半衰期很短。本专利通过将一段具有稳定功能的短肽序列加到TP508的N端，显著的提高了半衰期，稳定性也大幅的提高。本专利对TP508进行改造主要有以下理由(一)TP508分子量比较小，半衰期短可以较好地解决此处肽键酸解断裂的问题。(二)通过对融合肽的二级结构的模拟及根据相关文献资料报道，发现加上了稳定肽不会影响TP508其二级结构和三级结构的形成，即保证改造后TP508生物活性的稳定。三.
技术实现思路
本专利技术的一个方面，涉及一种凝血酶片段融合肽，其为SEQ ID N0:1所示的 S-TP508。作为本专利技术中的融合蛋白，是一类自然界没有的人工蛋白，其特征为稳定肽和 TP508组成的融合蛋白，可以使用一种具有序列表中SEQ ID NOl的序列，也可以使用对序列表 SEQ IDNOl中融合蛋白的氨基酸序列加以修饰，如插入，缺失，突变某个或某些氨基酸而得到的序列，只要基本保持原分子的生物活性即可。换句话说，也可以使用采用其氨基酸序列大体上与序列表SEQ ID NOl中融合蛋白氨基酸序列相同的蛋白，即使用氨基酸序列具有大于等于90%序列同一性的变体或其功能性片段。本领域普通技术人员知晓，所述S-TP508可以通过基因重组表达的方法或者化学合成的方法制备。在本专利技术中，所述S-TP508是通过基因工程重组表达的方法获得的。在本专利技术的一个实施方案中，通过如下方法获得S-TP508，包括如下步骤1)表达载体的构建依据已知S-TP508氨基酸序列(SEQ ID NO 1)，选用大肠杆菌偏好密码子全基因合成目的基因序列，同时在相应于所编码的氨基酸序列之N末端和C末端加上限制性酶切位点，得到S-TP508的核酸序列。再分别将如上述制备的目的基因序列以及筛选质粒pBSK 用限制性内切酶处理好，经计算各样品浓度后按一定摩尔比加入T4连接体系。经转化、筛选成功的重组子。用限制性酶切下目的基因，再将该基因与用限制性酶处理好的本研究所质粒 PGM (该质粒为卡那霉素抗性筛选标记，能大量表达GST类融合蛋白，为本研究所构建)连接，经筛选得到正确地重组子。2)目的蛋白的表达及分离纯化将如上述所得重组子转化到表达宿主菌，经表达筛选出高表达基因工程菌，然后经发酵，得到目的蛋白高表达的工程菌。高压均质机破碎细菌并离心得到含目的前体蛋白上清液，将上清液上样到GST亲和柱上，洗脱目的前体蛋白并用蛋白酶酶切后，再将样品通过阴离子柱进一步纯化，使得最终蛋白纯度大于98%的终产物。本专利技术的另一方面，涉及一种药物组合物，其含有本专利技术所述的S-TP508，以及任选的药物上可接受的载体。在本专利技术知，术语“药物上可接受的”意味着制药领域公认的可用于动物，更特别的是可用于人的。术语“载体”指稀释剂、佐剂(例如(完全或不完全)弗氏佐剂)、赋形剂、或用于容纳或施用治疗剂的介质。这些药用载体可以是无菌液体，诸如水和油，包括源自石油、动物、植物、或合成的油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油、诸如此类。静脉内施用药用组合物时，水是优选的载体。盐水溶液以及水性右旋糖和甘油溶液也可用作液态载体，特别是用于可注射溶液。合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油、滑石、氯化钠、奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇、诸如此类。如果需要， 组合物还可以包含较少数量的润湿或乳化剂如透明质酸钠，或是PH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳状液、片剂、丸剂、胶囊粉剂、缓释配方、诸如此类的形式。在本专利技术的一个实施方案中，所述药物组合物为冻干注射剂形式，其中含有 0. 01% -0. 2%的S-TP508，以及5%的甘露醇，以及药物上可接受的载体。将本专利技术的药用组合物配制成与其意向施用路径相容。施用路径的实例包括但不限于肠胃外，例如静脉内、皮内、皮下、口腔、鼻内(例如吸入)、经皮(例如局部)、经粘膜、 和直肠施用。在一个具体实施方案中，依照常规流程将组合物配制成适合静脉内、皮下、肌肉内、口腔、鼻内、或局部施用于人类的药用组合物。通常，用于静脉内施用的组合物是无菌等渗水性缓冲液中的溶液。如果需要，组合物还可以包含增溶剂和局部麻醉剂诸如麦角胺以减轻注射部位的疼痛。本专利技术的一个实施方案中，所述组合物为滴眼液，其中含有50-500 μ g/ml的 S-TP508,以及选自氯霉素或氧氟沙星的抗生素，以及药物上可接受的载体；在本专利技术的又一实施方案中，所述组合物为滴眼液，其中含有50-500 μ g/ml的S-TP508，适量的透明质酸钠，以及药物上可接受的载体；在本专利技术的另一实施方案中，所述组合物为滴眼液，其中含有50-500 μ g/ml的S-TP508，适量的透明质酸钠，氯霉素或氧氟沙星，以及药物上可接受的载体。若要局部施用本专利技术的组合物，则可以将组合物配制成软膏、乳膏、皮肤贴、洗剂、凝胶、洗发剂、喷雾剂、气雾剂、溶液、乳液的形式或是本领域技术人员众所周知的其它形式。参阅例如《雷明顿氏药物科学和药物剂型导论》(Remington' s Pharmaceutical Sciences andlntroduction to Pharmaceutical Dosage Forms),第 19版,Mack出版公司， 伊斯顿，宾夕法尼亚，1995年。对于非可喷雾局部剂量形式，通常采用包含与局部应用相容的载体或一种或多种赋形剂且具有优选大于水的动态粘滞度的粘性至半固体或固体形式。合适的配方包括但不限于溶液、悬浮液、乳状液、乳膏、软膏、粉剂、搽剂、药膏、诸如此类，如果需要，是无菌的或与辅助试剂(例如防腐剂、稳定剂、润湿剂缓冲剂、或盐)混和以改变各种特性，诸如例如渗透压。其它合适的局部剂量形式包括本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种含凝血酶片段的融合肽（Ｓ－ＴＰ５０８），其氨基酸序列为ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１：ＧＰＲＫＫＲＲＱＲＲ　ＲＡＧＹＫＰＤＥＧＫ　ＲＧＤＡＣＥＧＤＳＧ　ＧＰＦＶ

【技术特征摘要】
1.一种含凝血酶片段的融合肽(S-TP508)，其氨基酸序列为SEQ ID NO 1 :GPRKKRRQRR RAGYKPDEGK RGDACE⑶SG GPFV2.一种多核苷酸序列，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李树民，莘旭妮，李咏梅，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所，
类型：发明
国别省市：82