本发明专利技术公开了一种抗对虾白斑综合症病毒工程蛋白TAT-VP28-GH及制备和用途，其序列为SEQIDNO：1所示的核苷酸和SEQIDNO：2所示的氨基酸序列，菌株为重组基因工程菌株EscherichiacoliBL21pET-32a-TAT-VP28-GH。从对虾体中提取WSSV并通过PCR获得VP28基因，通过PCR的方法扩增TAT-VP28序列。取鲤鱼脑垂体，提取总mRNA，通过RT-PCR得到总cDNA，再PCR获得鲤鱼生长激素成熟肽基因，其上游插入了酸水解位点天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro-Asp)；然后构建重组质粒pET-32a-TAT-VP28-GH。将重组质粒pET-32a-TAT-VP28-GH转化大肠杆菌BL21，在IPTG的诱导下，融合蛋白TAT-VP28-GH以可溶的形式得到高效表达,该融合蛋白能有效地预防对虾患对虾白斑综合症及促进对虾生长发育。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因生物工程
更具体涉及一种重组融合蛋白TAT-VP^-GH 亚单位疫苗，同时还涉及一种大肠杆菌基因工程菌株的制备方法，具体涉及构建和高效表达可溶一种蛋白转导结构域多肽(TAT-PTD)，对虾白斑综合症病毒囊膜蛋白VP^和鲤鱼生长激素(carp mature growth hormone)成熟肽(简称GH)的融合蛋白的基因工程菌株；还涉及上述菌株表达的融合蛋白抗对虾白斑综合症病毒和促进对虾生长的用途。
技术介绍
对虾养殖业是我国沿海地区海水养殖的支柱性产业，1990年代初，全国对虾养殖面积达到16万公顷，最高年产量达到22万吨，约占全球对虾养殖总产量的30%。1988-1992 年，以中国对虾为主要养殖品种的我国对虾养殖产量连续5年居世界第一，年产值40多亿人民币。从1992年开始，在沿海对虾养殖地区暴发了大规模对虾病毒性流行病虾白斑综合症病毒(White Spot Syndrome Virus，WSSV)，是中国对虾养殖业的主要病原，该病是一种病程短、死亡率高的疾病。对对虾养殖业造成了巨大的经济损失。WSSV是一种有囊膜的环状双链DNA病毒，其形态学与杆状病毒相似，呈长杆状， 具有双层囊膜。完整的病毒粒子主要包括囊膜、核衣壳及病毒核心三部分。自WSSV在全世界范围内爆发以来，ICTV现将WSSV列为新建的线头病毒科(Nimaviridae)、白斑病毒属 (Whispovirus)的代表种。WSSV有较广的宿主范围，除了可以感染虾、蟹类等甲壳动物外， 桡足类及部分节肢动物也可以成为该病毒的传播者及携带者。目前有三株毒株全基因组序列已经测定。(1)台湾株(WSSV-TW，GenBank accession No. AF440570)，病毒分离自台湾的斑节对虾((Penaeusmonodon)，序列全长 307，； (2)泰国株(WS SV-TH，GenBank accession No. AF369029)病毒分离自泰国的斑节对虾(Penaeus monodon)，以克氏鳌虾 (Procafnbarus clarkia)作宿主感染增殖后纯化测序，序列全长292，967bp ； (3)中国株 (WSSV-CN, GenBank accession No. AF332093)，病毒分离自中国大陆的日本对虾(Penaeus japonicus)，序列全长305，107bp。基因组序列分析表明3株WSSV分离株的核营酸序列有99. 32%的同源性。迄今为止，科学家们发现WSSV完整粒子的结构蛋白Structural proteins)达到39个，其中囊膜蛋白(Envelope) 21个，核衣壳蛋白(Nucleocapsid) 10个， 被膜蛋白(Teguments个。囊膜蛋白是结构蛋白最主要的成员之一，一般认为这些蛋白与病毒和宿主细胞的结合、侵入以及子代病毒的包装有关。VP^是WSSV含量最丰富囊膜蛋白，它在N-末端和C-末端都具有穿膜结构，该蛋白还具有许多潜在糖基化位点。研究人员应用VP^蛋白的多克隆抗体进行了病毒的中和实验，结果表明VP^的抗体可以中和WSSV病毒颗粒，在一定程度上阻碍病毒的感染。目前用各种表达载体表达囊膜蛋白 VP^，其作为亚单位疫苗，口服、注射VP^免疫各种虾类并显著提高存活率的报道很多。如 Witteveldt利用原核表达载体在大肠杆菌中重组表达VP^融合蛋白，将纯化的VP^融合蛋白通过肌肉注射到对虾体内，在肌肉注射后第2天及第25天分别进行病毒攻击实验，结果发现与对照组相比，VP^融合蛋白注射组存在较高的相对存活率(Jeroen Witteveldt, Just M. Vlak, Marielle C. W. , van Hulten. Protection of Penaeus monodon against white spot syndrome virus using a WSSV subunit vaccine. Fish & Shellfish Immunology. 2004，16 :571-579)。Du利用昆虫细胞表达系统来表达重组的VP^蛋白，重组蛋白经肌肉注射进入鳌虾体内。并注射后第10天进行病毒攻击实验，结果发现昆虫细胞表达的重组蛋白与对照组相比，对鳌虾有较好的保护作用(Huahua Du, Zirong Xu, Xiaofeng ffu, Weifen Li, Wei Dai. Increased resistance to white spot syndrome virus in Procambarus clarkii by injection of envelope protein VP28 expressed using recombinant baculovirus · Aquaculture. 2006，260 :39_43) 。 Ning白勺夕少门氏菌作为转运载体，将带有vp^基因的真核表达载体pcDNA3. 1转化入减毒的沙门氏菌中，并将重组菌以口服的方式免疫克氏原鳌虾。在免疫后第7、15、25天分别进行病毒攻击实验，结果得到的相对存活率分别为88. 3%、66. 7%和56. 7% (Jian-Fang Ning,ffei Zhu, Jin-Ping Xu, Cong-Yi Zheng, Xiao—Lin Meng. Oral delivery of DNA vaccine encoding VP28 against white spot syndrome virus in crayfish by attenuated Salmonella typhimurium. Vaccine · 2009，27 :1127-1135)。蛋白质转导结构域(protein transduction domain,PTD)或称细胞穿膜肽(cell penetrating peptides, CPPs)是一条以肽为载体的有效运输各种物质进入细胞及细胞核的系统。通过PTD携带的物质有全长蛋白质、DNA、化学药物、寡核苷酸、40nm磁珠和200nm 脂质体等。现在研究最多、应用范围最广的蛋白转导域来源于人免疫缺陷病毒1型(HIV-I) W^13 (Trans-activating transcriptional activator, Tat) 0 Schwarze 石角定该蛋白转导功能的最小肽段是由11个氨基酸组成，其序列为YGRKKRRQRRR，该段等电点 12. 7，为碱性多肽，转导速度快，效率高。TAT可以将与之相连的多肽或全长蛋白质在数分钟内转导进入细胞，而且在体内可以通过血液循环运输至脑组织，跨越血脑屏障进入神经元或胶质细胞内。TAT蛋白质转导结构域序列中由于有6个精氨酸和2个赖氨酸残基，因此是带有高度正电荷的多肽。以不带电荷的丙氨酸替代其中的任何一个碱性氨基酸残基都会使穿膜活性降低，而替代序列中的其他氨基酸残基时穿膜活性则不会发生改变。这说明TAT 穿膜肽所带的正电荷是其穿膜功能所必需的，因此推测这些正电荷很可能是能够与真核细胞的细胞膜发生强的静电作用，从而介导了穿膜过程。鱼的生长激素是一种由鱼的脑垂体本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种分离的基因工程融合蛋白，其序列为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孟小林，徐进平，王健，张毅，
申请(专利权)人：广西南宁众达生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：45
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