一种肺肾两虚型肺癌小鼠模型制造技术

本发明专利技术属于中医肺癌证候研究技术领域，涉及一种肺肾两虚型肺癌小鼠模型的构建方法，可用于肺肾两虚型肺癌病证结合动物模型的制备。本发明专利技术采用小鼠肺气虚、肾虚模型和Lewis肺癌细胞移植瘤模型共同造模的制备方法，即皮下注射Lewis肺癌细胞建立肺癌移植瘤模型、采用烟熏刺激法建立肺气虚模型和腹腔注射氢化可的松法建立肾虚模型，其操作简单、造模周期短、成功率高、重复性好、稳定性好、经得起以方（药）测证检验，最重要的是既符合肺癌病理特征又具有中医理论特点，可结合中医理论知识综合分析小鼠肺肾两虚型肺癌动物模型的科学性，为研究中医药抗肺癌提供科学的研究工具。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于中医肺癌证候研究
，具体涉及一种肺肾两虚型肺癌小鼠模型，可用于肺癌肺肾两虚型肺癌病证结合动物模型的制备及评价。
技术介绍
肺癌是严重危害人类生命健康最常见恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率居恶性肿瘤之首。近年来，如何防治肺癌的研究已经成为国际学术界关注的焦点，也是我国有迫切需求、亟待发展的“人口与健康”研究领域中的重要研究内容。中医药治疗中晚期肺癌具有安全、副作用少等特点，能够明显延长患者的生存期，提高患者的生存质量。但因缺乏科学合适的动物模型，中医药治疗中晚期肺癌作用机制的研究比较零散滞后，国内至今缺乏系统、全面、深入的研究。单纯借鉴西医肺癌病理动物模型作为研究中医药抗肺癌的研究工具，缺乏中医理论特征，不符合中医理论的要求，难以真正反应中药复方抗肺癌的作用机制。因此积极探索和研究既符合肺癌病理特征又具有中医理论特点的病证结合动物模型势在必行，对研究和揭示中医药抗肺癌提供科学的研究工具具有重要意义。目前中医证候模型的构建思路主要有①病因造模病因造模只是单纯地考虑证候发生的某个或某些因素，而忽视证候的动态性和时空性，并不能一次性地客观地成功复制证候模型；②药物造模药物造模所致证候在临床实际很少见到，且存在致病因素撤除后动物易恢复，病因施加强度难控制，模型评价困难等问题；③病理造模虽然已经开始吸取西医在造模方面的成功经验，模拟出证候模型，但仍存在证候属性界定、评价困难及稳定不好等问题；④病证结合造模病证结合造模已成为中医证候动物模型的最新趋势，病证结合模型的优势体现在制作动物模型的同时复制出证候动态性、阶段性、个体性的特征，重视“病”与“证”之间的内在联系。病证结合动物模型是中医临床与基础之间的重要桥梁， 有助于中药、方剂作用机制的研究和满足新药开发的需要，且对于深层次探讨中西医理论的联系具有重要意义；同时使临床病理、药理得到直接、明确的阐述。肺癌多有“肺肾两虚”、“血瘀痰凝”、“脾虚痰湿”、“气滞血瘀”、“精气亏虚”等多种辨证分型。以邪盛正衰，本虚标实为根本。本课题组经过30年的临床实践认为，肺癌好发于中老年人群。《素问》曰“女子七七四十九、男子八八六十四，天癸竭”，天癸竭即中医所指的肾气衰退，精气亏耗之意。临床上肺癌患者多表现为咳嗽、形体消瘦、神疲乏力、腰膝酸软、 毛发脱落、记忆力下降等症状，均属久病及肾，肺肾两虚之证。我们认为“肺肾两虚”是肺癌的重要病机之一，并贯穿肺癌演进的始终。构建肺肾两虚型肺癌动物模型对于中医药抗肺癌作用机制的研究有着深远意义，遗憾的是目前关于肺肾两虚型肺癌动物模型尚无报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提出一种既符合肺癌病理特征又具有中医理论特色、操作简便，重复性好、稳定性好、经得起以方(药)测证检验的肺肾两虚型肺癌小鼠模型。本专利技术提出的肺肾两虚型肺癌小鼠模型，具体如下①Lewis肺癌细胞移植瘤模型将Lewis肺癌细胞株浓度调整为IX107ml ；用Iml注射器取上述悬液0. 2ml (含细胞数目2 X IO6个)，注射于小鼠左腋部皮下，即完成小鼠肿瘤接种；②复合模型组采用小鼠肺气虚、肾虚模型和Lewis肺癌细胞移植瘤模型共同造模的方法。肺气虚模型按照人民卫生出版社出版的《中医药动物实验方法学》中的烟熏刺激法改良后复制采用小鼠烟熏装置(专利号=201020532820. 2)，8_12只小鼠2支香烟，将点燃的香烟固定在烟熏装置内，2次/天，12分钟/次，持续14天。肾虚模型根据人民卫生出版社出版的《中医药动物实验方法学》中腹腔注射氢化可的松25mg/kg，1次/日，连续给药 14天。Lewis肺癌细胞移植瘤模型如前所述进行复制。本专利技术中，小鼠肺气虚模型、肾虚模型和Lewis肺癌细胞移植瘤模型为共同建模。实验研究表明，本专利技术的动物模型小鼠造模后在肺癌皮下移植瘤的基础上表现出毛发暗淡、眼睑下垂、小鼠缩肩拱背、自主活动减少、肌力减退、呼吸微弱、小便量增多、垂尾等肺肾两虚的症状，同时出现脾脏指数显著降低、胸腺和脾脏CD4+CD25+Treg细胞的含量明显增多及你即3 mRNA的表达水平上调等免疫功能异常的表现，初步建立符合中医理论特色的小鼠肺肾两虚型肺癌动物模型。肺岩宁方是由生黄芪、蜂房、干蟾皮、黄精、淫羊藿等组成的，具有益气养精、解毒散结之功效，补而不助邪，攻而不伤正，是临床治疗肺肾两虚型肺癌的经验方，临床疗效明确。本专利技术的动物模型建立后，用肺岩宁方进行干预，能明显缩小移植瘤的大小、改善模型的肺肾两虚症状以及相关的检测指标，这使得该模型的科学性得到进一步论证。另外，为增加以方(药)测证的科学性和客观性，本专利技术特设顺钼化疗组作为对照组，顺钼可以明显缩小移植瘤大小，但不能改善模型的肺肾两虚症状。按照本专利技术方法构建的动物模型与临床症状体征相同或相近、重复性好、稳定性好，并经得起以方(药)测证的检验。附图说明图1为本专利技术的构建方法示意图。图2为造膜后各组小鼠肺组织病理学图形比较。其中，A正常组，B模型组，C复合模型组。图3为药物干预后小鼠肺组织病理学图形比较其中。A复合模型组，B治疗组，C 化疗组，D综合治疗组。图中标号1为改良后烟熏刺激法建立肺气虚模型示意图，2为腹腔注射氢化可的松法建立肾虚模型示意图，3为左腋部皮下移植瘤建立方法示意图。具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术作进一步描述。(一)构建模型将M只近交系C57BL/6小鼠随机分为正常组、Lewis肺癌细胞皮下移植瘤模型组(简称模型组)、肺肾两虚型Lewis肺癌细胞移植瘤组(简称复合模型组)，每组8只。①Lewis肺癌细胞移植瘤模型的建立将Lewis肺癌细胞株浓度调整为IX IO7/ml ；用Iml注射器取上述悬液0. 2ml (含细胞数目2 X IO6个)，注射于小鼠左腋部皮下，即完成小鼠肿瘤接种。②复合模型组的建立采用小鼠肺气虚、肾虚模型和Lewis肺癌细胞移植瘤模型共同造模的方法。肺气虚模型按照人民卫生出版社出版的《中医药动物实验方法学》中的烟熏刺激法改良后复制自制小鼠烟熏装置(专利号=201020532820. 2)，8只小鼠2支香烟， 将点燃的香烟固定在烟熏装置上，2次/天，12分钟/次，持续14天。肾虚模型的建立根据人民卫生出版社出版的《中医药动物实验方法学》中腹腔注射氢化可的松25mg/kg，1次 /日，连续给药14天。Lewis肺癌细胞移植瘤模型如前所述进行复制。实验结果表明，复合模型组成瘤率100%，第5天开始小鼠的毛发暗淡，部分卷曲， 眼睑下垂和5/8小鼠缩肩拱背现象，第8天开始由于肿瘤负荷加重，出现活动受限，呼吸微弱，小便量增多，垂尾等肺肾两虚症状；复合模型组饲料消耗量逐渐减少，第7、11、14天复合模型组饲料消耗量与正常组、模型组比较有统计学意义(P <0.05，见表1);本专利技术的动物模型第15天体质量与正常组比较减小，有统计学意义(P <0.05，见表2); 复合模型组小鼠肺组织气管及各级支气管可见不同程度的慢性炎细胞包括淋巴细胞、浆细胞、单核细胞和少量中性粒细胞浸润，粘膜上皮可见纤毛倒伏、粘连或脱落，纤毛细胞可见变性、坏死或脱落，以及纤维组织增生。杯状细胞明显增多，胞体增大，管腔内有较多的分泌物，伴行各级气管的小血管周围亦可见明显的炎细胞浸润，肺泡隔增宽，内有炎细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种肺肾两虚型肺癌小鼠模型，其特征在于具体如下：（１）Ｌｅｗｉｓ肺癌细胞移植瘤模型：将Ｌｅｗｉｓ肺癌细胞株浓度调整为１×１０７／ｍｌ；用１ｍｌ注射器取上述悬液０．２ｍｌ，含细胞数目２×１０６个，注射于小鼠右腋部皮下，完成小鼠肿瘤接种；（２）复合模型组：肺气虚模型按照人民卫生出版社出版的《中医药动物实验方法学》中的烟熏刺激法改良后复制：采用小鼠烟熏装置，８－１２只小鼠２支香烟，将点燃的香烟固定在烟熏装置内，２次／天，１２分钟／次，持续１４天；肾虚模型的建立：根据人民卫生出版社出版的《中医药动物实验方法学》中腹腔注射氢化可的松２５ｍｇ／ｋｇ，１次／日，连续给药１４天；Ｌｅｗｉｓ肺癌细胞移植瘤模型如步骤（１）所述进行复制；其中，小鼠肺气虚模型、肾虚模型和Ｌｅｗｉｓ肺癌细胞移植瘤模型为共同建模。

【技术特征摘要】
1. 一种肺肾两虚型肺癌小鼠模型，其特征在于具体如下(1)Lewis肺癌细胞移植瘤模型将Lewis肺癌细胞株浓度调整为lX107/ml；用Iml 注射器取上述悬液0. 2ml，含细胞数目2 X IO6个，注射于小鼠右腋部皮下，完成小鼠肿瘤接种；(2)复合模型组肺气虚模型按照人民卫生出版社出版的《中医药动物实验方法学》中的烟熏刺激法改良后复制采用小鼠...

【专利技术属性】
技术研发人员：王菊勇，郭净，王青，郑展，
申请(专利权)人：上海中医药大学附属龙华医院，
类型：发明
国别省市：31