本发明专利技术公开了一种将鬼臼毒素生物转化为4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素的方法，包括：(1)、将鬼臼毒素加入到液体发酵培养基中，然后接种腐殖性土壤菌二级液体种子进行生物转化；(2)、将步骤(1)产物经分离纯化后加入到液体发酵培养基中，接种鬼臼类植物内生菌二级液体种子进行生物转化；随后添加川芎嗪继续生物转化，收集转化产物，即得。本发明专利技术还公开了从上述产物中分离纯化4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素及其含量检测的方法。本发明专利技术通过生物转化方法对鬼臼毒素分子结构进行修饰，具有反应条件温和、E-factor低、质量可控、分离过程简单等优点。
【技术实现步骤摘要】
,3,5,6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素的生物转化及分离纯化方法
本专利技术涉及一种鬼臼类化合物的制备方法，尤其涉及4- ，3，5，6_四甲基吡嗪-1-基)-4'-去甲表鬼臼毒素的生物转化方法，本专利技术还涉及该4- ，3，5，6_四甲基吡嗪-1-基)-4'-去甲表鬼臼毒素的分离纯化方法以及含量检测方法，属于鬼臼类化合物的生物转化领域。
技术介绍
，3，5，6_四甲基吡嗪-1-基)-4'-去甲表鬼臼毒素是一种鬼臼类化合物(又名 , 3, 5,6-tetramethylpyrazine-l) ~4' -demethylepipodophyllotoxine)，其结构式为图(I)所示。权利要求1.一种将鬼臼毒素生物转化为4- ，3，5，6_四甲基吡嗪-1-基)-4'-去甲表鬼臼毒素的方法，包括(1)、将鬼白毒素加入到液体发酵培养基中，然后接种腐殖性土壤菌二级液体种子进行生物转化，得到含有4'-去甲基表鬼白毒素的生物转化产物；( 、将步骤(1)所得到生物转化产物经分离纯化后加入到液体发酵培养基中，然后接种鬼白类植物内生菌二级液体种子进行生物转化，将4'-去甲基表鬼白毒素转化为4'-去甲基表鬼白毒酮；随后在液体发酵培养基中添加川芎嗪继续进行生物转化，得到含有4- ，3，5，6_四甲基吡嗪-1-基)-4'-去甲表鬼臼毒素的发酵液或菌丝体。2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的腐殖性土壤菌从湖北恩施或神农架等地的土壤中分离得到；优选的，所述的腐殖性土壤菌是藤仓赤霉(GilAerella fujikuroi)SH-fl3，其微生物保藏号是 CCTCC NO :M2010038 ；所述的鬼臼类植物内生菌从八角莲属(Dysosma)、桃儿七属(podophyllum)、山荷叶 (Diphylleia)或沙地柏(Sabina vulgaris Ant)中分离得到；优选的，所述的鬼臼类植物内生菌是细交链格孢(Alternaria alternata) S_f6，其微生物保藏号是CCTCC NO =M 2010037。3.按照权利要求1所述生物的方法，其特征在于所述的生物转化包括摇瓶级或生物反应器规模的生物转化；其中，步骤(1)或步骤O)中所述的生物转化温度为15-40°C，优选为30°C ；当采用摇瓶进行发酵时，所述的摇床转速为50-300转/分钟，优选的，所述的摇床转速为150转/分钟。4.按照权利要求1所述生物的方法，其特征在于步骤(1)中将鬼臼毒素作为底物加入到发酵培养基时，所加入用量为至终浓度0. 01-5克/升，优选为0. 2克/升；步骤(2)中在发酵培养基中添加川芎嗪至其终浓度为0. 01-5克/升，优选为0. 1克/升。5.按照权利要求1所述生物的方法，其特征在于步骤(1)中或步骤( 中所述的液体发酵培养基组成是酵母膏1-100克/升、硫酸镁0. 5-40克/升、磷酸氢二钾1-40克/升、 硫酸亚铁0. 01-10克/升、氯化钾0. 5-40克/升、pH值2-9 ；优选的，所述的液体发酵培养基的组成是酵母膏3克/升，硫酸镁0. 5克/升、磷酸氢二钾1克/升、pH值为7 ；所述的腐殖性土壤菌二级液体种子或鬼白类植物内生菌二级液体种子的制备包括以下步骤(1)培养斜面菌种；( 培养一级液体种子；( 培养二级液体种子；其中，培养斜面菌种中所用到的培养基和培养条件为培养基葡萄糖10-500克/升、硫酸镁0. 5-40克/升、磷酸二氢钾1-40克/升、盐酸硫胺0. 05-10克/升、琼脂20克/升、马铃薯提取液1. 0升；培养条件培养温度为15-40°C ；培养一级液体种子所用到的培养基和培养条件为培养基葡萄糖10-500克/升、酵母膏1-100克/升、硝酸钠1-50克/升、硫酸镁 0. 5-40克/升、磷酸氢二钾1-40克/升、硫酸亚铁0. 01-10克/升、氯化钾0. 5-40克/升； PH 值 2-9 ；培养条件培养温度15-40°C，摇床转速为50-300转/分钟；培养二级液体种子所用到的培养基和培养条件为培养基葡萄糖10-500克/升、酵母膏1-100克/升、硝酸钠1-50克/升、硫酸镁·0. 5-40克/升、磷酸氢二钾1-40克/升、硫酸亚铁0. 01-10克/升、氯化钾0. 5-40克/升； PH 值 2-9 ；培养条件培养温度15-40°C，摇床转速为50-300转/分钟。6.按照权利要求5所述的方法，其特征在于培养斜面菌种中所用到的培养基和培养条件为培养基葡萄糖30克/升、硫酸镁0. 5克/升、磷酸二氢钾1. 5克/升、盐酸硫胺0. 1 克/升、琼脂20克/升、马铃薯提取液1. 0升；培养条件培养温度为30°C ；培养一级液体种子所用到的培养基和培养条件为培养基葡萄糖30克/升、酵母膏3克/升、硝酸钠2克/升、硫酸镁0. 5克/升、磷酸氢二钾1克/升、硫酸亚铁0. 01克/升、氯化钾0. 5克/升，pH值7 ；培养条件培养温度30°C，摇床转速为150转/分钟；培养二级液体种子所用到的培养基和培养条件为培养基葡萄糖30克/升、酵母膏3克/升、硝酸钠2克/升、硫酸镁0. 5克/升、磷酸氢二钾1克/升、硫酸亚铁0. 01克/升、氯化钾0. 5克/升，pH值7 ；培养条件培养温度30°C，摇床转速为150转/分钟。7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤O)中所述的分离纯化包括(1)将生物转化基质离心，分别收集发酵上清液和菌丝体沉淀；菌丝体真空干燥；备用；( 分别制备发酵上清液待分离纯化样品或菌丝体待分离纯化样品；C3)依次使用硅胶柱层析和凝胶柱层析进行分离纯化，即得。8.按照权利要求7所述的方法，其特征在于步骤( 所述发酵上清液待分离纯化样品的制备方法，包括将发酵上清液通过液液萃取，收集有机层，浓缩挥干，得到发酵上清液待分离纯化样品；所述菌丝体待分离纯化样品的制备方法，包括将菌丝体蒸馏回流提取，用有机溶剂富集蒸馏液中的非极性成分，得菌丝体待分离纯化样品；步骤(3)中所述硅胶柱层析为正相硅胶柱层析或反相硅胶柱层析；正相硅胶以低极性有机溶剂拌勻后装柱，以洗脱液平衡；反相硅胶以甲醇拌勻后装柱，以洗脱液平衡；优选的，步骤(3)中将待分离纯化的样品以洗脱液溶解，采用硅胶柱层析吸附，然后用洗脱液洗脱，收集洗脱液，将样品挥干并重结晶；其中，以体积比为20 1的氯仿丙酮作为洗脱液； 将凝胶以甲醇浸泡，将处理好的凝胶装柱，以甲醇平衡；将经硅胶柱层析初步分离后的样品溶于甲醇中，进行上样吸附，然后用甲醇洗脱，收集洗脱液，将样品中溶剂挥干并重结晶，即得。9.由权利要求1-8任何一项方法所得到的生物转化产物。10.从权利要求9所述的产物中分离纯化4- ，3，5，6_四甲基吡嗪-1-基)-4'-去甲表鬼白毒素的方法，其特征在于，包括(1)将生物转化产物离心，分别收集发酵上清液和菌丝体沉淀；菌丝体真空干燥；备用；( 分别制备发酵上清液待分离纯化样品或菌丝体待分离纯化样品；C3)使用硅胶柱层析和凝胶柱层析进行分离纯化，即得。11.按照权利要求10所述的方法，其特征在于步骤( 所述发酵上清液待分离纯化样品的制备方法，包括将发酵上清液通过液液萃取，收集有机层，浓缩挥干，得到发酵上清液待分离纯化样品；所本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种将鬼臼毒素生物转化为４－（２，３，５，６－四甲基吡嗪－１－基）－４′－去甲表鬼臼毒素的方法，包括：（１）、将鬼臼毒素加入到液体发酵培养基中，然后接种腐殖性土壤菌二级液体种子进行生物转化，得到含有４′－去甲基表鬼臼毒素的生物转化产物；（２）、将步骤（１）所得到生物转化产物经分离纯化后加入到液体发酵培养基中，然后接种鬼臼类植物内生菌二级液体种子进行生物转化，将４′－去甲基表鬼臼毒素转化为４′－去甲基表鬼臼毒酮；随后在液体发酵培养基中添加川芎嗪继续进行生物转化，得到含有４－（２，３，５，６－四甲基吡嗪－１－基）－４′－去甲表鬼臼毒素的发酵液或菌丝体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：汤亚杰，赵巍，
申请(专利权)人：湖北工业大学，
类型：发明
国别省市：83
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