本发明专利技术公开了一种导致烟草青枯病的茄科雷尔氏菌高纯培养物制备和保存方法，将烟草青枯病典型症状的病株茎秆处置后，27～30℃无菌保湿培养12～24小时，获得含茄科雷尔氏菌培养物；经过TTC法鉴定、筛选含菌量在80％以上的高纯培养物；所获得的高纯培养物可采用保存液A在-20～-40℃恒温保存，或采用保存液B在20℃恒温保存；保存液A为100～200mL甘油和20～40g脱脂奶粉，加入蒸馏水溶解、定容至500mL，摇匀，常规灭菌后制得；保存液B是将1～2g的琼脂加入至1000mL蒸馏水中融化、摇匀，常规灭菌后制得。本发明专利技术的制备和保存方法简便、易行，目标菌纯度高、性状稳定，保存效果好。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物纯化、保存
，具体涉及一种导致烟草青枯病的茄科雷尔氏菌高纯培养物制备方法和两种保存方法。
技术介绍
烟草青枯病(Tobacco bacterial wilt)是烟草生产中的主要细菌病害之一，在中国大部分产烟区都有发生，而且有逐年加重的趋势。其病原菌是茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)，该菌的寄主广泛，现有技术可实现对该菌的分离、培养和保存，见《中国烟草病害》(朱贤朝，王彦亭，王智发，中国农业出版社，2002，152 163页)，其采取的培养方式为将分离的材料表面消毒后，取病组织加入灭菌水后剪碎或磨碎，再取剪碎或磨碎液在 TTC培养基上划线或涂布，27 30°C培养3 4天后，检查培养的菌落，选择病菌菌落转入斜面培养、保存。该方式存在的不足是病菌在人工培养基上转接多次会导致病菌的变异、 一些固有的特性会丧失；而且有可能因为病菌数量少分离不到病菌。方中达编著的《植物病研究方法》(中国农业出版社，1998，187 189页)记载，有关保存烟草青枯病菌菌株的方法有真空冷冻干燥保存、冷冻甘油保存、矿物油保存、斜面保存和无菌水常温保存等方式。 真空冷冻干燥保存烟草青枯病菌虽然保存时间长、保存效果好，但需要配套的昂贵设备、操作烦琐、技术难度大。冷冻甘油保存方式如果长期保存时会出现烟草青枯病菌菌株存活率低、致病力下降的问题。矿物油保存、斜面保存方式的保存时间短、保存效果不佳。无菌水常温保存，烟草青枯病菌菌体会沉淀，外界温度变化大，保存效果得不到保障。为了防止烟草青枯病菌在人工培养基上连续传代，出现致病力迅速下降或其它遗传性状的改变的问题，以及现有技术保存培养物的效果不确定的缺陷，发展一种经济有效的、并保持烟草青枯病致病菌固有特性的分离培养和保存方法，显得尤为必要。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种导致烟草青枯病的茄科雷尔氏菌高纯培养物制备方法，第二、三目的在于提供两种保存该高纯培养物的方法。本专利技术的第一目的是这样实现的，导致烟草青枯病的茄科雷尔氏菌高纯培养物制备方法，采取以下步骤A、原料的制备选具有烟草青枯病典型症状的病株茎秆用自来水洗净，经75%的酒精表面消毒2 3分钟后，用无菌水冲洗2 3次，然后在无菌条件下将病株茎秆截成 3 5cm的小段；B、保湿培养在27 30°C下，将病株茎秆小段的截口暴露于灭菌蒸馏水外，无菌保湿培养12 M小时，有浓稠状液体从截口处流出，浓稠状液体为含茄科雷尔氏菌培养物；C、选择高纯培养物采用半选择TTC法进行培养测定，用移菌环取B步骤所得的浓稠状液体，以含有0. 吐温_80、pH值为6. 8的灭菌磷酸缓冲液10倍系列稀释后，涂布于直径9 IOcm半选择TTC平板培养基上，27 30°C无菌培养3 4天后，选择含有80 120个菌落的培养基，且有环状螺纹、边缘白色中央粉红色的较大菌落占总菌落数80%以上的，即接种到该培养基上的浓稠状液体为含菌量在80%以上的含茄科雷尔氏菌高纯培养物。所述的无菌保湿培养是将病株茎秆小段置于灭菌的离心管或量筒中，用封口膜封口，病株茎秆小段的截口高出液面1 2cm。所述的离心管或量筒的内径比病株茎秆粗2 3mm。本专利技术第二个目的是这样实现的将高纯培养物加入到装有保存液A的保存容器中，保存时细菌浓度为1千万 10亿CFU/mL，将旋盖或扣盖盖紧后，用封口膜封口， 在-20 _40°C恒温保存；所述的保存液A是用100 200mL甘油和20 40g脱脂奶粉， 加入蒸馏水溶解、定容至500mL，摇勻，常规灭菌后制得。本专利技术第三个目的是这样实现的将高纯培养物加入到装有保存液B的保存容器中，保存时细菌浓度为1千万 10亿CFU/mL，将旋盖或扣盖盖紧后，用封口膜封口，在20°C 恒温保存；所述的保存液B是用1 2g琼脂加入至IOOOmL蒸馏水中融化、摇勻，常规灭菌后制得。上述两种保存方法中，所述的保存容器为1. 5mL的离心管或2. OmL的菌种保存管。本专利技术相对于现有技术具有以下技术效果1、获得高纯培养直接、快速、纯度高、性状稳定。利用目标菌的寄主植物——烟草， 其茎秆微管系统发达的特性，直接将具有烟草青枯病典型症状的病株茎秆进行保湿培养， 从而获得高纯培养物。这种方法避免了人工培养基导致病株传代中致病力下降或遗传性状改变的问题。配合半选择 TTC培养基(Granada G A, Sequeira L. Survival of Pseudomonas solanacearum in soil, rhizosphere and plant roots. Can. J. Microbiol. ,1983,29 433 440.)进行稀释分离、筛选高纯培养物，可经济、有效地获得固有特性保持良好的菌株。2、保存方法简便易行、保存效果好。保存目标菌的高纯培养物，可根据需要选择采用两种方法，即利用保存液A在-20 _40°C冷冻保存和利用保存液B在20°C恒温保存。冷冻保存将培养物作为菌种资源长期保存，如不反复冻融，可有效保存病菌10年以上；采用恒温保存，培养物中菌体存活率高，转接方便，可以有效保存病菌至少5年。具体实施例方式下面对本专利技术作进一步的说明，但不以任何方式对本专利技术加以限制，基于本专利技术教导所作的任何变换，均落入本专利技术的保护范围。一种导致烟草青枯病的茄科雷尔氏菌高纯培养物制备方法，采取以下步骤A、原料的制备选具有烟草青枯病典型症状的病株茎秆用自来水洗净，经75%的酒精表面消毒2 3分钟后，用无菌水冲洗2 3次，然后在无菌条件下将病株茎秆截成 3 5cm的小段；B、保湿培养在27 30°C下，将病株茎秆小段的截口暴露于灭菌蒸馏水外，无菌保湿培养12 M小时，有浓稠状液体从截口处流出，浓稠状液体为含茄科雷尔氏菌培养物；C、选择高纯培养物采用半选择TTC法进行培养测定，用移菌环取B步骤所得的浓稠状液体，以含有0. 吐温-80、pH值为6. 8的灭菌磷酸缓冲液10倍系列稀释后，涂布于直径9 IOcm半选择TTC平板培养基上，27 30°C无菌培养3 4天后，选择含有80 120个菌落的培养基，且有环状螺纹、边缘白色中央粉红色的较大菌落占总菌落数80%以上的，即接种到该培养基上的浓稠状液体为含菌量在80%以上的含茄科雷尔氏菌高纯培养物。上述制备方法中，所述的无菌保湿培养是将病株茎秆小段置于灭菌的离心管或量筒中，用封口膜封口，病株茎秆小段的截口高出液面1 2cm。所述的离心管或量筒的内径比病株茎秆粗2 3_。一种保存上述高纯培养物的方法，将高纯培养物加入到装有保存液A的保存容器中，保存时细菌浓度为1千万 10亿CFU/mL，将旋盖或扣盖盖紧后，用封口膜封口， 在-20 -40°C恒温保存；所述的保存液A是用100 200mL甘油和20 40g脱脂奶粉， 加入蒸馏水溶解、定容至500mL，摇勻，常规灭菌后制得。另一种保存上述高纯培养物的方法，将高纯培养物加入到装有保存液B的保存容器中，保存时细菌浓度为1千万 10亿CFU/mL，将旋盖或扣盖盖紧后，用封口膜封口，在 20°C恒温保存；所述的保存液B是用1 2g琼脂加入至IOOOmL蒸馏水中融化、摇勻，常规灭菌后制得。上述保存方法中，所述的保存容器为1. 5mL的本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种导致烟草青枯病的茄科雷尔氏菌高纯培养物的制备方法，其特征是采取以下步骤：Ａ、原料的制备：选具有烟草青枯病典型症状的病株茎秆用自来水洗净，经７５％的酒精表面消毒２～３分钟后，用无菌水冲洗２～３次，然后在无菌条件下将病株茎秆截成３～５ｃｍ的小段；Ｂ、保湿培养：在２７～３０℃下，将病株茎秆小段的截口暴露于灭菌蒸馏水外，无菌保湿培养１２～２４小时，有浓稠状液体从截口处流出，浓稠状液体为含茄科雷尔氏菌培养物；Ｃ、选择高纯培养物：采用半选择ＴＴＣ法进行培养测定，用移菌环取Ｂ步骤所得的浓稠状液体，以含有０．１％吐温－８０、ｐＨ值为６．８的灭菌磷酸缓冲液１０倍系列稀释后，涂布于直径９～１０ｃｍ半选择ＴＴＣ平板培养基上，２７～３０℃无菌培养３～４天后，选择含有８０～１２０个菌落的培养基，且有环状螺纹、边缘白色中央粉红色的较大菌落占总菌落数８０％以上的，即接种到该培养基上的浓稠状液体为含菌量在８０％以上的含茄科雷尔氏菌高纯培养物。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：方敦煌，晋艳，宋春满，胡坚，秦西云，余清，
申请(专利权)人：云南省烟草农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：53
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