本发明专利技术涉及一种黑斑蛙抗菌肽及其基因和应用，属于生物医学技术领域。黑斑蛙抗菌肽是中国两栖类动物黑斑蛙基因编码的一种单链多肽，黑斑蛙抗菌肽是中国两栖类黑斑蛙抗菌肽基因编码的一种单链多肽，分子量1495.85道尔顿，等电点9.0，黑斑蛙抗菌肽全序列为：缬氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-缬氨酸-丝氨酸-甘氨酸-亮氨酸-亮氨酸-丝氨酸-丝氨酸-亮氨酸-亮氨酸-甘氨酸-赖氨酸。其编码基因由333个核苷酸组成，其中编码成熟部分的为第142–186位核苷酸。人工合成的黑斑蛙抗菌肽具有很强的抗菌作用，同时其安全性高，并且还具有序列简单、合成方便的优点，可做为新型抗感染药物进行应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术提供一种黑斑蛙、Raim nigromaculata)抗菌肽及其基因和应用，属于生物医学
技术介绍
在中国的中药和民族医药中，许多两栖类动物被作为药用材料并被广泛的应用，如中华蟾蜍QBufo gargarizans )、大蹼铃蟾iBombirm maxima )和黑斑蛙(Rana nigromaculata)等。这些两栖类动物的皮肤和内脏具有广泛的药理活性和临床疗效，已报道药理活性有广谱抗菌、抗肿瘤、抗病毒、镇痛、免疫调节等，具有生物医药产业开发的价值。目前也存在着一个主要的问题，就是在中药和民族医药中，药用材料是以整体的方式进行炮制及应用的，其成分的复杂性可能会造成药物活性成分不能更好发挥作用，因而从传统药物中寻找特定的活性单体物质是中药现代化的重要内容之一。在国外，两栖类皮肤特定药理活性单体化合物的寻找已经成为新药专利技术的热点。 如从非洲爪蟾Cfez70jOT1S hehs)体内分离的maganin具有强大的抗菌功能，目前已完成两个三期临床试验并取得较好结果，虽然未被美国食品与药品监督局批准上市，但其临床前研究仍在进行中。我国对两栖类药物的应用有悠久的历史，但对其活性成分和药理性质的研究主要集中于生物碱等有机小分子，对其皮肤活性蛋白肽类物质的研究还较少。黑斑蛙是我国传统中药材的一种，广泛分布于东亚各地，其广泛分布可能与其适应环境能力较强有关，关于黑斑蛙抗菌肽的报道较少。将本专利技术的黑斑蛙抗菌肽氨基酸全序列及其编码基因分别在蛋白质数据库和基因数据库进行比对搜索，均未发现有任何相同序列信息。
技术实现思路
本专利技术的目的是基于现有技术基础，提供一种新的具有强烈抗菌活性的黑斑蛙抗菌肽及其基因和应用。黑斑蛙抗菌肽是中国两栖类黑斑蛙抗菌肽基因编码的一种单链多肽，分子量 1495. 85道尔顿，等电点9. 0，黑斑蛙抗菌肽全序列为缬氨酸-异亮氨酸_脯氨酸_异亮氨酸-缬氨酸-丝氨酸-甘氨酸-亮氨酸-亮氨酸-丝氨酸-丝氨酸-亮氨酸-亮氨酸-甘氨酸-赖氨酸。黑斑蛙抗菌肽基因通过从黑斑蛙皮肤提取总RNA、反转录、设计引物及PCR方法筛选得到，扩增引物长度为23个核苷酸，其序列为5’ - ATGTTCACCACAAAGAAATCCAT-3’， PCR另一扩增引物为逆转录过程中加入的接头引物，其序列为 5’ -TCGACGATTAGGCGGCCGACATGT-3’，将所获得的阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定，基因测序结果表明编码黑斑蛙抗菌肽的基因由333个核苷酸组成，自5’端至3’端序列为atgttcacca tgaagaaatc cctcttactc cttttcttcc ttggaaccat caacttatct 60ctctgtgagc aagagagaga tgccgatgag gaagaaagaa gagatgatcc atatgaaacg 120 gatactgaag tgcaaaaacg agttatacca attgtgtcag gtctgctctc tagtttgttg 180 gggaagtagc caaaaatttt gaaactttaa aaatggaaaa ggaaatcatc tgatgtgata 240 tatcatttag ctaaatgctc aacagatgtc ttataaaaaa taaataaata tgttgcatgc 300333编码黑斑蛙成熟抗菌肽的序列为第145 - 186位核苷酸，其编码的氨基酸序列为Vla lie Pro lie Via Ser Gly Leu Leu Ser Ser Leu Leu Gly Lys0本专利技术采用自动多肽合成仪合成黑斑蛙抗菌肽全序列，通过HPLC反相C18柱层析脱盐、纯化后用HPLC方法鉴定其纯度，以基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 (MALDI-T0F-MS)测定其精确分子量，并用自动氨基酸测序仪测定其氨基酸序列。本专利技术的有益效果在于由黑斑蛙抗菌肽编码基因推导其氨基酸结构，采用自动多肽合成仪合成的黑斑蛙抗菌肽具有广谱抗菌活性，且无溶血作用。该黑斑蛙抗菌肽具有结构简单、人工合成方便、抗菌活性强、抗菌谱广和无明显副作用的特点。具体实施例方式下面用实施例来进一步说明本专利技术，但本专利技术的内容并不局限于此。实施例1 黑斑蛙抗菌肽基因克隆 1、黑斑蛙皮肤总RNA提取A.活体黑斑蛙用水清洗干净，放入液氮中速冻4小时，取皮肤组织，称重，取300mg皮肤组织，加入IOml总RNA提取缓冲液(Trizol溶液，美国Invitrogen公司产品)，于20ml 玻璃勻浆器中勻浆10分钟。B.加入等体积酚/氯仿溶液，振荡混勻，室温放置10分钟，4°C，12000rpm离心10 分钟，吸取上层水相液体。C.上清液中加入1/2体积的异丙醇，室温放置10分钟，4°C下7500g离心10分钟， 沉淀用75%乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为黑斑蛙皮肤总RNA。2、黑斑蛙皮肤RNA逆转录合成cDNA第一链黑斑蛙皮肤RNA逆转录合成cDNA第一链采用日本TAKARA公司的Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H")试剂盒进行。A.取黑斑蛙皮肤总RNA 500 μ g溶于500 μ 1 DEPC水中待用。B.在0. 2ml无菌无RNA酶的离心管加入1 μ 1黑斑蛙皮肤RNA、1 μ 1逆转录引物 (5，-TCGACGATTAGGCGGCCGACATGTTTTTTTTTTTTTCTTT-3，)及 4ul DEPC 水，混勻后 70°C保温 10分钟后迅速在冰上急冷5分钟。C.瞬时离心使模板RNA/引物的变性溶液聚集于离心管底部。D.加入 2ul 5XM-MLV 缓冲液、0.5ul dNTP 混合物(各 10 mM)、0. 25ul RNase Inhibitor (40 U/μ l)、0.25ul RTase M-MLV (RNase H" ) (200 U/μ 1)禾口 Iul DEPC 水， 42°C保温1小时后，70°C保温15分钟后冰上冷却，得到的cDNA溶液可直接用于黑斑蛙抗菌肽编码基因的扩增。3、黑斑蛙抗菌肽编码基因的扩增A. 95°C 预热 PCR 仪。B.将2μ1 cDNA第一链(第2步骤中的产物)、75. 5μ1 去离子水、10μ1 PCR 缓冲液、8μ1 dNTP 混合物(各 2. 5uM)、2 μ 1 5，PCR 弓丨物(5，- ATGTTCACCACAAAGAAATCCAT-3，)、2 μ 1 3，PCR 弓丨物 (5，-TCGACGATTAGGCGGCCGACATGT-3)以及0. 5 μ 1大肠杆菌DNA聚合酶放入离心管中进行反应。C.在PCR仪中按以下程序扩增(1)预变性95 0C5分秒钟(2)25个循环95 0C30秒钟56 0C30秒钟72 0C30秒钟(3)后扩增72 0C5分钟D.循环结束后，将PCR产物用TIANGEN公司的DNA产物纯化试剂盒进行抽提回收，步骤如下(1)将PCR产物与等体积的膜结合缓冲液颠倒混勻，然后将混和液转入离心纯化柱， 室温静置5分钟，使DNA充分与硅胶膜结合。12000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。(2)加入700 μ 的漂洗液(含乙醇)于离心纯化柱中，本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．黑斑蛙抗菌肽是中国两栖类动物黑斑蛙基因编码的一种单链多肽，其特征是分子量１４９５．８５道尔顿，等电点９．０，多肽氨基酸全序列为：缬氨酸－异亮氨酸－脯氨酸－异亮氨酸－缬氨酸－丝氨酸－甘氨酸－亮氨酸－亮氨酸－丝氨酸－丝氨酸－亮氨酸－亮氨酸－甘氨酸－赖氨酸。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：宋玉竹，孟庆雄，余旭亚，李涛，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：53
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