双层人工皮肤及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种双层的人工皮肤移植物，它包括：（ａ）真皮层，所述的真皮层含有聚羟基乙酸等生物可降解材料、成纤维细胞和基质蛋白；（ｂ）位于真皮层一个主表面之上的表皮层。在本发明专利技术的人工皮肤中，有连续的表皮细胞生长在成纤维细胞－ＰＧＡ复合物表面，且表皮细胞分化良好，有较明显的分层。切片显示组织工程人工皮肤具有和正常人体皮肤相似的组织结构特征。本发明专利技术还提供了该人工皮肤的制备方法和用途。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医学和生物医学工程领域，更具体地涉及以聚羟基乙酸为支架构建的双层人工皮肤，及其制备方法和用途。
技术介绍
皮肤被覆于人体全身表面，与外界环境直接接触，是解剖学和生理学上的重要边界器官。皮肤约占成人体重的16％，面积约1.2-2.2m2。皮肤由表皮和真皮组成，借皮下组织与深部的深筋膜、腱膜或骨膜相连。皮肤起源于外胚层和中胚层，结构较复杂并高度特化，有重要的屏障作用和保护作用，可防止外界的刺激损伤体内的组织，能阻挡异物和微生物侵入，并可阻止体液外渗和对外界物质的吸收。皮肤作为人体最大的器官，是与外界环境接触的屏障。当由于外界损伤或疾病等因素造成皮肤缺损时，其危害可以极轻微，也可以是致命的。皮肤缺损修复的历史可以追溯到数百年前。目前常用修复途径有自体植皮、同种异体植皮、异种植皮，但由于供区不足、免疫排斥及传播疾病等缺点，寻找一种理想的皮肤替代物一直是临床上一个亟需解决的难题(Naughton GK.Skin and Epithelia.In Lanza RP，Langer R，Chick WL.Principles of Tissue Engineering.R.G.Landes Company and AcademicPress，Inc.，1997，769.)。组织工程学是应用工程学和生命科学的原理与方法，构建生物性替代物，以恢复、维持或增进受损器官或组织功能的一门科学(Nerem RM.Tissueengineering in the USA.Med Biol Eng Comput，1992，30(4)CE8)。“组织工程”的提出为人工构建一种皮肤替代物提供了崭新且富有挑战性的途径。Dermagraft是由Advanced Tissue Sciences公司生产的一种人工真皮。将从新生儿包皮中获取的成纤维细胞接种于生物可降解的合成材料聚羟基乙酸(PGA)网架上，14-17天后，成纤维细胞大量增殖并分泌胶原、纤维连接蛋白、蛋白多糖、生长因子等，形成由成纤维细胞、细胞外基质和可降解生物材料构成的人工真皮。Dermagraft主要用于烧伤创面及慢性溃疡创面的修复(Eaglstein WH，Falanga V.Tissue engineering for skinAn update.JAm Acad Dermatol，1998，39(6)1007)。然而，Dermagraft是只具有人工真皮层的单层组织工程皮肤，移植于创面后仍需一期或二期移植自体断层皮片。理想的组织工程化皮肤应包含表皮与真皮两层，因为表皮与真皮无论在解剖上还是在功能上都是相互依存的整体。Apligraft(又称作Graftskin)是第一种商品化的既含有表皮层又含有真皮层的组织工程化皮肤，这种由Organogenesis公司注册生产的产品已在加拿大和美国获准用于临床治疗静脉性溃疡及糖尿病足部溃疡。Apligraft的制法是将从新生儿包皮中获取的成纤维细胞接种于牛I型胶原，1周后再在其表面接种新生儿角质形成细胞。4天后角质形成细胞融合成片，覆盖其下的“真皮层”。整个复合物随后被置于气-液界面以促使角质形成细胞进一步分化成熟。在一项临床研究中，Apligraft与传统治疗静脉性溃疡的压迫疗法相比较，6个月治愈率分别为63％和48.8％(P＝0.012)；平均愈合时间分别为61天和181天(P＝0.003)；对于超过6个月的难治性溃疡Apligraft治疗组愈合时间明显短于对照组(92天/190天，P＝0.001)(Falanga V，Margolis D，Alvarez O，et al.Rapid healing of venous ulcers and lackof clinical rejection with an allogeneic cultured human skinequivalent.Arch Dermatol，1998，134293.)。然而，Apligraft的缺点是胶原凝胶的收缩率较大；使用同种异体细胞和牛胶原，存在着不可预料的免疫排斥反应和潜在病毒感染的风险；脆性大，操作困难。因此，本领域迫切需要开发新的安全性高、可操作性强的人工皮肤代用品。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种新的安全性高、制法简便的人工皮肤。本专利技术的另一目的就是提供所述人工皮肤的制法和用途。在本专利技术的第一方面，提供了一种人工皮肤移植物，它包括(a)真皮层，所述的真皮层含有药学上可接受的生物可降解材料、成纤维细胞和基质蛋白；(b)位于真皮层一个主表面之上的表皮层。在一优选例中，所述的药学上可接受的生物可降解材料选自聚羟基乙酸、聚乳酸、聚乳酸-甘醇酸、或其混合物。在另一优选例中，所述的真皮层含有10-30％聚羟基乙酸，5-15％成纤维细胞，55-85％基质蛋白。更佳地，所述的真皮层含有15-25％聚羟基乙酸，5-15％成纤维细胞，60-80％基质蛋白。在另一优选例中，所述的真皮层的厚度为0.2-4mm，所述表皮层的厚度是20-120um。在另一优选例中，所述的表皮层含有角质形成细胞。在另一优选例中，所述的成纤维细胞选自真皮成纤维细胞，以及胚胎时期间充质细胞来源的多种结缔组织细胞、内皮细胞和平滑肌细胞。在另一优选例中，所述的表皮角质形成细胞和成纤维细胞包括经过基因修饰、改造的表皮角质形成细胞和成纤维细胞。在本专利技术的第二方面，提供了一种制备人工皮肤移植物的方法，包括步骤(a)将成纤维细胞接种于药学上可接受的生物可降解材料；(b)在适合生长的条件下培养，从而形成成纤维细胞-药学上可接受的生物可降解材料复合物；(c)将角质形成细胞接种于所述的成纤维细胞-药学上可接受的生物可降解材料复合物表面；(d)在适合角质形成细胞生长的条件下培养，从而形成成纤维细胞-药学上可接受的生物可降解材料-表皮复合物。在一优选例中，所述的药学上可接受的生物可降解材料选自聚羟基乙酸、聚乳酸、聚乳酸-甘醇酸、或其混合物；在另一优选例中，在步骤(a)中，成纤维细胞的接种量为1×105-1×107个细胞/10mg生物可降解材料(如聚羟基乙酸)。更佳地，成纤维细胞的接种量为5×105-5×106个细胞/10mg生物可降解材料(如聚羟基乙酸)。在另一优选例中，在步骤(c)中，角质形成细胞的接种量为1×104-1×107个细胞/平方厘米。更佳地，角质形成细胞的接种量为1×105-5×106个细胞/平方厘米。在另一优选例中，步骤(d)包括二个阶段(i)将步骤(c)获得的复合物在完全浸没的条件下，于37±0.5℃，5％CO2和饱和湿度下培养4-14天，从而使角质形成细胞增殖，形成角质形成细胞层；(ii)将步骤(i)中获得的复合物的角质形成细胞层部分暴露于空气中，继续培养4-21天，从而使角质形成细胞角化。附图描述附图说明图1是本专利技术双层人工皮肤的组织学切片照片。图2A和2B是本专利技术双层人工皮肤的透射电镜照片。具体实施例方式本专利技术人经过广泛而深入的研究，改进了双层人工皮肤的结构和制备方法，首次制得了基于聚羟基乙酸(Polyglycolic Acid，PGA)等生物可降解材料的双层人工皮肤。本专利技术的双层人工皮肤具有真皮及表皮双层结构，无收缩，可以直接缝合覆盖创面，替代自体皮肤移本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人工皮肤移植物，其特征在于，它包括： （ａ）真皮层，所述的真皮层含有药学上可接受的生物可降解材料、成纤维细胞和基质蛋白； （ｂ）位于真皮层一个主表面之上的表皮层。

【技术特征摘要】
1.一种人工皮肤移植物，其特征在于，它包括(a)真皮层，所述的真皮层含有药学上可接受的生物可降解材料、成纤维细胞和基质蛋白；(b)位于真皮层一个主表面之上的表皮层。2.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的药学上可接受的生物可降解材料选自聚羟基乙酸、聚乳酸、聚乳酸-甘醇酸、或其混合物，并且所述的真皮层含有10-30％聚羟基乙酸，5-15％成纤维细胞，55-85％基质蛋白。3.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的真皮层含有15-25％聚羟基乙酸，5-15％成纤维细胞，60-80％基质蛋白。4.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的真皮层的厚度为0.2-4mm，所述表皮层的厚度是20-120um。5.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的表皮层含有角质形成细胞，6.如权利要求5所述的移植物，其特征在于，所述的表皮角质形成细胞和成纤维细胞包括经过基因修饰、改造的表皮角质形成细胞和成纤维细胞。7.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的成纤维细胞选自真皮成纤维细胞，以及胚胎时期间充质细胞来源的多种结缔组织细胞、内皮细胞和平滑肌细胞。8.一种制备人工皮肤移植物的方法，其特征在于，包括步骤(a)将成纤维细胞接种于药学上可接受的生物可降解材料；(b)在适...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹谊林，杨光辉，崔磊，刘伟，
申请(专利权)人：上海组织工程研究与开发中心，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]