样品的预处理方法及HCV的免疫测定方法技术

本发明专利技术提供HCV核心蛋白检测用样品的预处理方法，其特征在于，在利用使用粒子的免疫测定法的HCV核心蛋白的检测中，将疑似含丙型肝炎病毒(HCV)的样品用含碱性物质的试剂处理，再用含酸性物质的试剂中和处理时，任何试剂含还原剂；另外提供，HCV核心蛋白检测用试剂盒，判断样品中有无丙型肝炎病毒的方法，及HCV的免疫测定方法。

【技术实现步骤摘要】
样品的预处理方法及HCV的免疫测定方法
本专利技术涉及HCV核心蛋白检测用样品的预处理方法，HCV核心蛋白检测用试剂盒， 判断样品中有无丙型肝炎病毒的方法，及HCV的免疫测定方法。
技术介绍
丙型肝炎是丙型肝炎病毒(HCV)引起的传染性的疾病。不仅尚未确立丙型肝炎的 予防法，感染者(携带者)的多是被推定为经10 30年向肝硬化或肝癌转移，HCV感染的 早期发现和早期治疗非常重要。作为丙型肝炎的病原体的HCV是直径约60nm的RNA病毒，具有包膜。HCV的RNA 是单链正链，由约9500个碱基序列构成。基因结构类似于黄病毒，5’末端和3’末端有非翻 译区(UTR)，其间存在编码约3000个氨基酸的翻译区。翻译区从5’侧有编码结构蛋白的核 心区，包膜区1，包膜区2，接着存在非结构区。作为HCV检测用方法，已知以核心区编码的HCV核心蛋白作为抗原，使用免疫学手 法来检测的方法。其中，HCV核心蛋白存在于具有包膜的HCV的内部。因此，以HCV核心蛋 白作为抗原检测时，需要将HCV核心蛋白从HCV游离。作为将HCV核心蛋白从HCV游离的 预处理方法，已知将HCV用碱性溶液处理后，用酸性溶液中和的预处理方法。例如，日本公 开号特开2001-004621号公报中公开了通过将疑似含丙型肝炎病毒的样品用含非离子表 面活性剂，蛋白变性剂及碱性物质的试剂处理的第1处理步骤，及将第1处理步骤中得到的 样品用含酸性物质的试剂处理的第2处理步骤来游离HCV核心蛋白的预处理方法。作为HCV检查，已知以核心区编码的HCV核心蛋白作为抗原使用的抗体测定法。 但是，利用上述抗体测定法的HCV检查在感染HCV至抗体产生前不可检测丙型肝炎。因此， HCV的早期发现困难。而且抗体检查在原理上存在不可判别是感染后治愈者，还是活动性的 感染者的问题。其中，作为解决这样的问题的HCV检查，有直接检测HCV抗原的方法。作为这样的 方法，已知使用对于HCV的核心抗原有特异性的单克隆抗体来检测血清中的核心抗原的方 法(日本授权专利第3176570号，日本授权专利第3623162号)。但是，由于HCV感染患者内病毒粒子本身极少，因此盼望着比上述测定法更高灵 敏度的HCV的检测法。确认有无HCV感染时，需要检测从被验者采取的活体样品中所含的微量的HCV。因 此，HCV的检测要求灵敏度。其中，作为以高灵敏度检测抗原的方法，已知免疫复合物转移 测定法(日本公开特开平1-254868号，日本公开特开平2-28558号)。此免疫复合物转移 测定法是以将含测定对象物质的免疫复合物在2种以上的固相间移动后，测定固相上的免 疫复合物为特征的方法。通过将含测定对象物质的免疫复合物在2种以上的固相间移动来 除去杂质，可减少检测系统中的非特异的信号。结果，通过使用免疫复合物转移测定法，可 以高灵敏度检测测定对象物质。但是，已知作为丙型肝炎的病原体的HCV是RNA病毒，引起高度的变异。例如，在SEQ ID NO :2所示的HCV基因型Ib的核心区蛋白质的第49位的氨基酸有变异时，即便用 使用了上述公知的抗体的上述免疫复合物转移测定法测定HCV，也有无法以高灵敏度检测 的情况(Journal Of Clinical Microbiology，S印t. 2000，ρ· ；3450_3452)。
技术实现思路
本专利技术的范围仅由随附的权利要求确定，它不以任何方式受此
技术实现思路
部分记载 的影响。S卩，本专利技术提供(1)利用使用粒子的免疫测定法预处理丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白检测用样 品的方法，包括将疑似含丙型肝炎病毒的样品用含碱性物质的试剂处理；及将第1处理步骤中得到的样品用含酸性物质的试剂处理；其中含碱性物质的试剂及含酸性物质的试剂中的至少一种含还原剂；(2) (1)的方法，其中还原剂是选自下列的至少1种巯基乙胺，巯基乙醇，二硫苏 糖醇，半胱氨酸，二硫丁四醇，硼氢化钠及膦；(3) (1)或O)的方法，其中第1处理步骤中使用的试剂还含非离子表面活性剂；(4) (3)的方法，其中非离子表面活性剂选自聚氧乙烯系非离子表面活性剂；(5)⑴ (4)中任一项的方法，其中第1处理步骤中使用的试剂还含离液剂；(6) (5)的方法，其中离液剂是选自下列的至少1种尿素，胍盐酸盐，水杨酸钠，乙 酰胺及甲酰胺。(7)⑴ (6)中任一项的方法，其中碱性物质是选自下列的至少1种氢氧化钠， 氢氧化钾及氢氧化镁；(8) (1) (7)中任一项的方法，其中酸性物质是选自下列的至少1种醋酸，乳 酸，柠檬酸，苹果酸，琥珀酸，磷酸，蚁酸，富马酸，酒石酸，盐酸及硫酸；(9) (1) (8)中任一项的方法，其中粒子是磁性粒子；(10)⑴ (9)中任一项的方法，其中第1处理步骤及第2处理步骤中使用的试剂 中的至少一种含无机盐类；(11) (10)的方法，其中无机盐类是选自下列的至少1种氯化钠，氯化钾，氯化镁 及硫酸钠；(12) (9)的方法，其中免疫测定法是将液相中形成的含HCV核心蛋白，抗HCV核心 蛋白抗体及磁性粒子的复合物通过磁分离来从液相分离而检测HCV核心蛋白的免疫测定 法；(13)利用使用粒子的免疫测定法的丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白检测用试剂盒， 其含含碱性物质的第1试剂；及含酸性物质的第2试剂；其中第1试剂及第2试剂中的至少一种含还原剂；(14) (13)的试剂盒，其中第1试剂及第2试剂中的至少一种含无机盐类；(15) (13)或(14)的试剂盒，其中第1试剂还含非离子表面活性剂；(16) (13) (15)中任一项的试剂盒，其中第1试剂还含离液剂；(17) (13) (16)中任一项的试剂盒，其还含含结合于HCV核心蛋白的标记抗体的第3试剂；含结合于HCV核心蛋白的第1抗体的第4试剂；含粒子的第5试剂；含与第1抗体及粒子结合的第2抗体的第6试剂；及固定有与第1抗体结合的物质的固相；(18) (17)的试剂盒，其中标记抗体及第1抗体分别结合到HCV核心蛋白的不同部 位，且结合部位中不含SEQ ID NO :2所示的HCV核心蛋白的第49位的氨基酸；(19) (18)的试剂盒，其中标记抗体及第1抗体的结合部位是SEQ ID NO 2所示的 HCV核心蛋白的第21 30位的氨基酸序列或第41 48位的氨基酸序列；(20) (19)的试剂盒，其中用作标记抗体及第1抗体的抗体是由选自独立行政法人 制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心中保藏的保藏号NITE BP-844及NITE BP-843 的杂交瘤产生的单克隆抗体。(21)判断样品中有无丙型肝炎病毒的方法，包括将疑似含丙型肝炎病毒的样品用含碱性物质的试剂处理；将第1处理步骤中得到的样品用含酸性物质的试剂处理；在粒子上形成含结合于HCV核心蛋白的标记抗体及第2处理步骤中得到的样品中 所含的HCV核心蛋白的复合物；形成步骤后，将样品中的粒子与样品中所含的其他成分分离；将分离步骤中得到的粒子上形成的复合物转移到与所述粒子不同的固相；测定转移步骤中得到的转移到与所述粒子不同的固相的复合物的标记；及基于测定步骤的结果，判断样品中有无丙型肝炎病毒；其中含碱性物质的试剂及含酸性物质的试剂中的至少一种含还原剂；(22)丙型肝炎病毒(HCV)的免疫测定方法，包括在第1固相上形成含本文档来自技高网...

【技术保护点】
利用使用粒子的免疫测定法预处理丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心蛋白检测用样品的方法，包括：●将疑似含丙型肝炎病毒的样品用含碱性物质的试剂处理；及●将第１处理步骤中得到的样品用含酸性物质的试剂处理；其中含碱性物质的试剂及含酸性物质的试剂中的至少一种含还原剂。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：山垣内孝博，武田和彦，高马卓也，
申请(专利权)人：希森美康株式会社，
类型：发明
国别省市：JP