为了测定糖化胺的样品前处理方法和糖化胺的测定方法技术

本发明专利技术提供以糖化胺为测定对象的样品的前处理方法，并以可能进行可信的优良糖化胺测定为目的。使果糖基氨基酸氧化酶(FAOD)作用于样品中的糖化氨基酸而将其分解后，进一步使FAOD作用于前述样品中的测定对象糖化胺，通过测定其氧化还原反应而测定糖化胺的量。作用于糖化氨基酸的FAOD和作用于糖化胺的FAOD可以具有相同的底物特异性，也可以具有不同的底物特异性。当使用相同的FAOD时，在使FAOD作用于糖化氨基酸而将其分解后，通过蛋白酶使前述FAOD失活，同时分解前述糖化胺，进一步添加相同的FAOD使之作用，测定其氧化还原反应。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及。
技术介绍
以往，利用氧化还原反应测定样品中的测定对象的量已广泛实施，其也适用于生化分析、临床检查等中糖化胺(糖化蛋白质、糖化肽、糖化氨基酸等)的测定。特别地，血液中的糖化蛋白质，特别是其中的红细胞中的糖化血红蛋白反映机体血糖值的过去的历史，因此是糖尿病诊断、治疗等中的重要指标。例如，如下所示，用前述氧化还原反应，测定这种红细胞中的糖化蛋白质。首先，将红细胞溶血以制备样品，将果糖基氨基酸氧化酶(以下称为“FA0D”)加到此溶血样品中，其作用于糖化蛋白质的糖化部分，从而通过氧化还原反应生成过氧化氢。此过氧化氢量对应于前述糖化蛋白质量。然后，将过氧化物酶(以下称为“POD”)和通过氧化而显色的还原剂加到此样品中，从而以前述POD为催化剂在前述过氧化氢和前述还原剂之间发生氧化还原反应。通过前述反应使前述还原剂显色，通过测定这种显色而可以测定前述过氧化氢量，结果是，可以得知红细胞中的糖化蛋白质量。
技术实现思路
但是，用这种氧化还原反应测定糖化蛋白质的方法有这样的问题，例如，生成比对应于样品中实际所含糖化蛋白质的过氧化氢更多的过氧化氢。而且，取决于患者，糖化蛋白质的测定值暂时急剧升高，从而无法进行可信的测定。因此，前述方法需要进一步提高测定精度。而且，不限于在用前述氧化还原反应的测定方法，例如，在用抗原抗体反应的糖化胺测定方法中也同样需要提高测定精度。因此，本专利技术的目的是提供用于测定糖化胺的样品前处理方法，借此使糖化胺的高度可信的测定成为可能。为了达成前述目的，本专利技术提供以糖化胺为测定对象的样品的前处理方法，所述方法包括使FAOD作用于前述样品中存在的除测定对象糖化胺以外的糖化氨基酸或糖化肽而分解之，以除去前述糖化氨基酸或糖化肽。前述“FA0D”是一般名称，其底物不限于糖化氨基酸，例如，其还作用于糖化肽。而且，在本专利技术中，“糖化肽”指FAOD起作用的长度的肽，例如，氨基酸残基数在2-6范围内的肽。因此，在本专利技术中，FAOD不起作用的长度的糖化肽和糖化蛋白质总称为“糖化蛋白质”。 这样，作为测定对象的前述糖化胺，例如，包括糖化蛋白质、糖化肽和糖化氨基酸。本专利技术的专利技术人进行了深入研究以提高测定精度，并最终发现以下的事实。S卩，在全血中，除本来存在测定对象糖化胺以外，还存在测定对象以外的游离糖化氨基酸和糖化肽，前述FAOD也对这种糖化氨基酸和糖化肽起作用。因此，如果如上述用FAOD进行糖化胺的测定，则不仅在测定对象糖化胺和FAOD之间发生氧化还原反应，而且在测定对象以外的糖化氨基酸、糖化肽和FAOD之间发生氧化还原反应，从而在表面上增加测定对象的测定值。而且，关于前述问题，即就同一患者的全血样品而言，即使在完全相同的条件下通过前述测定方法进行测定，从患者采血时间不同时测定值也显著变化，还发现了以下事实。艮口， 这个问题是主要见于接受点滴等的患者的现象，作为点滴成分，例如，含有葡萄糖等糖类和各种氨基酸时，由这些外来成分形成糖化氨基酸，糖化氨基酸暂时增加，导致上述测定值变化。这种现象不仅存在于前述通过氧化还原反应的测定中，例如，在前述用抗原抗体反应的测定方法中也同样出现。因此，本专利技术的专利技术人发现，即使全血样品中存在正常的糖化氨基酸或糖化肽、暂时的外来糖化氨基酸或糖化肽等除测定对象以外的糖化物，如果如本专利技术那样预先对样品进行前处理，使分解用FAOD作用于除测定对象以外的糖化氨基酸、糖化肽，就可以抑制如前述的表面上的测定值升高。通过其可以提高测定精度，此外，例如，由于与是否接受点滴无关，采血可以在任何时间进行，因此可以减少患者的负担。因此，这样的样品前处理方法，例如，如果应用于前述的糖化血红蛋白的测定，则糖化血红蛋白作为糖尿病诊断指标的可靠性得以提高，从而成为临床医疗等领域中的有用方法。其次，本专利技术提供通过使FAOD作用于样品中的糖化胺，测定其氧化还原反应而测定糖化胺的量的方法，所述方法包括在前述氧化还原反应之前，预先用前述本专利技术的前处理方法处理前述样品而分解前述样品中存在的除糖化胺以外的糖化氨基酸或糖化肽，以除去前述糖化氨基酸或糖化肽。由于如前述的理由，可以通过这种测定方法提高测定精度。在下文中，在本专利技术中，用于分解前述糖化氨基酸、糖化肽的FAOD称为“分解用FA0D”，而用于作用于前述糖化胺的FAOD称为“测定用FA0D”。而且，存在的除测定对象糖化胺以外的糖化氨基酸和糖化肽在下文中称为“非测定对象糖化物”。本专利技术的测定方法，例如，可以是使用对前述非测定对象糖化物和前述测定对象糖化胺具有不同底物特异性的FAOD的第一测定方法，和使用相同的FAOD的第二测定方法。在FAOD中，如后述，例如，存在作用于α-氨基的糖化部分的FA0D，作用于赖氨酸、精氨酸等氨基酸残基的侧链氨基的糖化部分的FA0D，和作用于前述两者的糖化部分的 FA0D，它们的底物特异性取决于FAOD的种类而不同。因此，在糖化胺的测定中，通过使FAOD 作用于前述α-氨基的糖化部分、前述侧链氨基的糖化部分或两者的糖化部分，可能测定其量。在本专利技术的第一测定方法中，优选作用于前述非测定对象糖化物的分解用FAOD 和作用于测定对象糖化胺的测定用FAOD具有不同的底物特异性。由此，用分解用FAOD分解前述非测定对象糖化物的糖化部分，而糖化胺的未经前述分解用FAOD作用的糖化部分然后受到具有不同底物特异性的测定用FAOD的作用，因此，可以不受前述非测定对象糖化物的影响，从而提高测定精度。具体而言，例如，如果非测定对象的α-氨基被糖化，而测定对象糖化胺的α-氨基糖化部分和侧链氨基被糖化，则优选前述分解用FAOD是特异性作用于糖化α -氨基的酶，而前述测定用FAOD是特异性作用于糖化α-氨基和糖化氨基酸残基侧链的酶。由于前述测定用FAOD作用于α -氨基糖化部分和侧链氨基糖化部分二者，因此如果是以往的方法，它还作用于如前述的α-氨基被糖化的非测定对象糖化物。但是，在本专利技术中，由于预先用特异性作用于前述糖化α -氨基的分解用FAOD分解前述非测定对象糖化物的糖化部分，因此测定用FAOD不作用于它们，从而抑制了表面上的测定值增加，提高了精度。而且， 由于测定用FAOD如前述作用于α -氨基糖化部分和侧链氨基糖化部分二者，通过分解用 FAOD分解糖化胺的α -氨基糖化部分，因此测定用FAOD能够仅作用于糖化胺的侧链氨基糖化部分。因此，其特别地是以侧链氨基的糖化量为特征的糖化胺的测定中的有用方法。这种糖化胺的实例是糖化赖氨酸和糖化白蛋白等。当使用这种不同的FAOD时，优选在使FAOD作用于前述非测定对象糖化物之前或之后，用蛋白酶分解糖化胺，并使测定用FAOD作用于这种糖化胺分解物，从而进行前述氧化还原反应。分解糖化胺是因为，当测定对象为糖化蛋白质时，FAOD难以作用于前述糖化蛋白质，而作用于如前述的糖化肽和糖化氨基酸，并且，对前述糖化氨基酸的作用比对前述糖化肽的作用更为容易。而且，蛋白酶处理的顺序不受非测定对象糖化物的分解处理前后的限制的原因是，由于测定用FAOD可以作用于不同于如前述的分解用FAOD的糖化部分，因此糖化胺本身的测定不受影响。而且，当测定对象是糖化肽时，因为如果分解成更短的糖化肽或糖化氨基酸，则FAOD更容易地作用，因此优选进行蛋白酶处理。本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种糖化蛋白质的含量的测定方法，其通过用蛋白酶对样品中的糖化蛋白质进行处理，然后用果糖基氨基酸氧化酶即ＦＡＯＤ对生成的糖化氨基酸和／或糖化肽进行处理，从而测定糖化蛋白质的含量，其特征在于，包含下述前处理工序：在用蛋白酶对糖化蛋白质进行处理之前，通过使果糖基氨基酸氧化酶即ＦＡＯＤ作用于所述样品中可能存在的非糖化蛋白质来源的糖化氨基酸，从而对所述糖化氨基酸进行分解处理。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：米原聪，小森胤树，
申请(专利权)人：爱科来株式会社，
类型：发明
国别省市：JP