本发明专利技术公开了一种检测维生素C工业混菌发酵过程中细胞内蛋白质变化方法，包括如下步骤：(1)对维生素C发酵过程中所用的巨大芽孢杆菌(Bacillus?megaterium)和氧化葡糖杆菌(Gluconobacter?oxydans)细胞内的蛋白质进行测定：(2)聚类分析；(3)过程分析，利用本发明专利技术的方法可以从整体上研究维生素C工业混菌发酵过程中，细胞内蛋白变化规律，找到发酵过程中的重要蛋白，这些蛋白含量的变化规律为了解发酵过程的内在机理提供依据，从而为进一步优化发酵过程，提高维生素C产量，降低环境污染提供理论基础。同时也为其他混菌发酵过程的研究提供新的思路和方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于工业微生物领域，涉及一种检测维生素C工业混菌发酵中细胞内蛋白质变化的方法。
技术介绍
蛋白质是构成细胞的重要组成部分，是生理功能的调控者和执行者，是生命现象的直接体现者，对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明细胞在不同生长条件下的变化机制。一方面可以对其上游的基因组学信息进行验证，另一方面又可以对其下游的代谢物研究提供指导。蛋白组学的发展，主要依托高效的蛋白分离和鉴定技术，二维凝胶电泳是目前最经典的蛋白分离方式，可以在一块胶上分离几百甚至上千种蛋白质，同时，质谱技术的发展使得蛋白鉴定准确度大大提高。基于二维凝胶电泳分离，MALDI-T0F/T0F鉴定蛋白技术的使用，可以从整体水平上检测细胞在发酵过程中各种结构蛋白以及功能蛋白的变化水平。维生素C的工业混菌发酵是由巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌共同作用完成发酵的，其内在调控机理尚不明确，这就使优化工业生产过程变得困难，也增加了生产中控制发酵过程的难度。
技术实现思路
本专利技术的目的是通过高通量的蛋白组学的手段来了解维生素C混菌发酵过程中的蛋白质变化规律，进一步揭示两种菌在发酵过程中的相互关系，从而弥补现有混菌发酵过程难于控制的不足，提供一种检测维生素C工业混菌发酵过程中细胞内蛋白质变化方法。本专利技术的技术方案概述如下一种检测维生素C工业混菌发酵过程中细胞内蛋白质变化方法，其特征是包括如下步骤(1)对维生素C发酵过程中所用的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和氧化葡糖杆菌(GluconcAacter oxydans)细胞内的蛋白质进行测定①细胞收集及淬灭将所述巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌进行发酵，在发酵过程中选3-5个时间点， 所述时间点位于所述发酵过程的前期、中期和后期，在所述时间点快速取出发酵液样品，离心，收集下层的细胞，并用磷酸盐缓冲液清洗，立即用液氮淬灭，终止代谢反应；用液氮研磨用于破碎细胞，获得3-5份破碎细胞；②提取细胞内蛋白取步骤①获得的3-5份破碎细胞100 200mg分别置于离心管中，加入0. 5 2ml 细胞裂解液，混勻，冰上间歇超声破碎20 50s ；加入5 15 μ L的质量比为2 4 1的 DNase I/RNaseA酶混合溶液，混勻，4°C静置反应10 30min ；加入5 15 μ L 80 120mM 的苯甲基磺酰氟异丙醇溶液，4°C静置1 汕；15000rpm离心25 40min ；取上清，加4 6倍体积的_20°C _40°C的丙酮，沉淀12 20h ；离心，弃上清，沉淀用_20°C _40°C的体积浓度为70% -85%的丙酮水溶液洗涤；冷冻干燥备用；③蛋白浓度测定将牛血清蛋白由低浓度到高浓度加入考马斯亮蓝G-250溶液中，测定蛋白在 595nm处的吸光值，建立标准曲线；将步骤②获得的蛋白分别溶于300 μ L溶胀液中，测定蛋白浓度；并分别按500 1000 μ g分装，_80°C贮存，所述溶胀液为8mol -L-I尿素，质量浓度为2%的CHAPS，体积百分浓度为0. 5%的IPG buffer，余量为水；④一维等电聚焦电泳采用胶内泡胀上样法，将步骤③获得的各个500 1000 μ g蛋白样品溶液用溶胀液补齐至350 μ L，加入1. 0 1. 5mg 二硫苏糖醇，均勻铺于胶槽内，放入IPG干胶条，覆盖一层矿物油，盖上胶槽盖，进行一维等电聚焦电泳；用平衡液I平衡10 20min、平衡液II 平衡10 20min ；所述平衡液I的组成为50mmol 'L-IpH为8. 8的iTris-HCl,质量浓度为 2%的SDS，质量浓度为 2%的二硫苏糖醇，6mol · L-I尿素，体积浓度为20 40%的甘油，痕量的溴酚蓝，余量为水；所述平衡液II的组成为50mmol · L-IpH为8. 8的Tris-HCl，质量浓度为2%的 SDS，质量浓度为2% 3%的碘乙酰胺，6mol · L-I尿素，体积浓度为20 40%的甘油，痕量的溴酚蓝，余量为水；⑤SDS-PAGE 电泳配制SDS-PAGE溶液质量浓度为11% 15%的聚丙烯酰胺，3. 75M*L_lpH为8. 8 的Tris-HCl，质量浓度为1%。的SDS，质量浓度为0. 2%。 0. 3%。的过硫酸铵，体积浓度为 0. 5%。 1. 5%。的N，N，N’，N’ -四甲基乙二胺，余量为水；待胶凝后得到凝胶，将步骤④获得的平衡后的胶条放入凝胶上端，放入HkD IlOkD蛋白marker，加入4 5ml质量浓度为 0.9% 1.5%的低熔点琼脂糖水溶液，待胶凝后，将其放入垂直电泳槽中，在80 100V恒压下进行第二维电泳，直到溴酚蓝到达胶的前沿时停止；⑥图像分析将步骤⑤获得的凝胶染色，用扫描仪投射扫描，将得到的图像用ImageMaster软件进行分析，得到蛋白相对含量的数据，找出明显的差异蛋白；⑦差异表达蛋白鉴定将差异蛋白在37°C，用胰蛋白酶胶内酶切，通过质谱MALDI-T0F-T0F，测定差异蛋白；(2)聚类分析采用Expanderi 0对步骤(1)⑥中得到的数据进行标准化后，进行K-means聚类， 得到具有不同变化规律的数据类别，获得候选差异蛋白；(3)过程分析将步骤( 获得的候选差异蛋白含量按照时间序列制成图表，观察并分析这些蛋白变化的规律，进而发现其在维生素C工业混菌发酵过程中的作用。利用本专利技术的方法可以从整体上研究维生素C工业混菌发酵过程中，细胞内蛋白变化规律，找到发酵过程中的重要蛋白，这些蛋白含量的变化规律为了解发酵过程的内在机理提供依据，从而为进一步优化发酵过程，提高维生素C产量，降低环境污染提供理论基础。同时也为其他混菌发酵过程的研究提供新的思路和方法。 附图说明图1为维生素C发酵过程中不同时间点SDS-PAGE胶图；图2为巨大芽孢杆菌胞内与芽孢形成相关蛋白含量在发酵过程中的变化趋势；图3为维生素C混菌发酵过程中蛋白聚类分析；图4为氧化葡糖杆菌胞内与生长及产酸相关蛋白含量在发酵过程中的变化趋势；图5为维生素C混菌发酵过程嘌呤代谢中相关蛋白含量变化趋势。具体实施例方式下面的实施例可以使本领域技术人员更全面的理解本专利技术，但不以任何方式限制本专利技术。下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明本专利技术所用的细胞裂解液7mol · L-I尿素，2mol · L-I硫尿，质量浓度为的4% CHAPS,40mmol · L-lTris，余量为水。实施例1一种检测维生素C工业混菌发酵过程中细胞内蛋白质变化方法，包括如下步骤(1)对维生素C发酵过程中所用的巨大芽孢杆菌(Bacillus me gat erium) CGMCC No 1. 459和氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)CGMCC No 1. 110细胞内的蛋白质进行测定①细胞收集及淬灭将所述巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌进行发酵，在发酵过程中选3-5个时间点， 所述时间点位于所述发酵过程的前期、中期和后期，在所述时间点快速取出发酵液样品，离心，收集下层的细胞，并用磷酸盐缓冲液清洗，立即用液氮淬灭，终止代谢反应；用液氮研磨用于破碎细胞，获得5份破碎细胞；②提取细胞内蛋白取步骤①获得的3-5份破碎细胞100 200mg分别置于离心管中，加入0. 5 2ml 细胞裂解液，混勻，冰本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种检测维生素Ｃ工业混菌发酵过程中细胞内蛋白质变化方法，其特征是包括如下步骤：（１）对维生素Ｃ发酵过程中所用的巨大芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）和氧化葡糖杆菌（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）细胞内的蛋白质进行测定：①细胞收集及淬灭：将所述巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌进行发酵，在发酵过程中选３－５个时间点，所述时间点位于所述发酵过程的前期、中期和后期，在所述时间点快速取出发酵液样品，离心，收集下层的细胞，并用磷酸盐缓冲液清洗，立即用液氮淬灭，终止代谢反应；用液氮研磨用于破碎细胞，获得３－５份破碎细胞；②提取细胞内蛋白：取步骤①获得的３－５份破碎细胞１００～２００ｍｇ分别置于离心管中，加入０．５～２ｍｌ细胞裂解液，混匀，冰上间歇超声破碎２０～５０ｓ；加入５～１５μＬ的质量比为２～４∶１的ＤＮａｓｅ Ｉ／ＲＮａｓｅＡ酶混合溶液，混匀，４℃静置反应１０～３０ｍｉｎ；加入５～１５μＬ ８０～１２０ｍＭ的苯甲基磺酰氟异丙醇溶液，４℃静置１～３ｈ；１５０００ｒｐｍ离心２５～４０ｍｉｎ；取上清，加４～６倍体积的－２０℃～－４０℃的丙酮，沉淀１２～２０ｈ；离心，弃上清，沉淀用－２０℃～－４０℃的体积浓度为７０％－８５％的丙酮水溶液洗涤；冷冻干燥备用；③蛋白浓度测定：将牛血清蛋白由低浓度到高浓度加入考马斯亮蓝Ｇ－２５０溶液中，测定蛋白在５９５ｎｍ处的吸光值，建立标准曲线；将步骤②获得的蛋白分别溶于３００μＬ溶胀液中，测定蛋白浓度；并分别按５００～１０００μｇ分装，－８０℃贮存，所述溶胀液为：８ｍｏｌ·Ｌ－１尿素，质量浓度为２％的ＣＨＡＰＳ，体积百分浓度为０．５％的ＩＰＧ ｂｕｆｆｅｒ，余量为水；④一维等电聚焦电泳采用胶内泡胀上样法，将步骤③获得的各个５００～１０００μｇ蛋白样品溶液用溶胀液补齐至３５０μＬ，加入１．０～１．５ｍｇ二硫苏糖醇，均匀铺于胶槽内，放入ＩＰＧ干胶条，覆盖一层矿物油，盖上胶槽盖，进行一维等电聚焦电泳；用平衡液Ｉ平衡１０～２０ｍｉｎ、平衡液ＩＩ平衡１０～２０ｍｉｎ；所述平衡液Ｉ的组成为：５０ｍｍｏｌ·Ｌ－１ｐＨ为８．８的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，质量浓度为２％的ＳＤＳ，质量浓度为１％～２％的二硫苏糖醇，６ｍｏｌ·Ｌ－１尿素，体积浓度为２０～４０％的甘油，痕量的溴酚蓝，余量为水；所述平衡液ＩＩ的组成为：５０ｍｍｏｌ·Ｌ－１ｐＨ为８．８的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，质量浓度为２％的ＳＤＳ，质量浓度为２％～３％的碘乙酰胺，６ｍｏｌ·Ｌ－１尿素，体积浓度为２０～４０％的甘油，痕量的溴酚蓝，余量为水；⑤ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳配制ＳＤＳ－ＰＡＧＥ溶液：质量浓度为１１％～１５％的聚丙烯酰胺，３．７５Ｍ·Ｌ－１ｐＨ为８．８的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，质量浓度为１‰的ＳＤＳ，质量浓度为０．２‰～０．３‰的过硫酸铵，体积浓度为０．５‰～１．５‰的Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四甲基乙二胺，余量为水；待胶凝后得到凝胶，将步骤④获得的平衡后的胶条放入凝胶上端，放入１４ｋＤ～１１０ｋＤ蛋白ｍａｒｋｅｒ，加入４～５ｍｌ质量浓度为０．９％～１．５％的低熔点琼脂糖水溶液，待胶凝后，将其放入垂直电泳槽中，在８０～１００Ｖ恒压下进行第二维电泳，直到溴酚蓝到达胶的前沿时停止；⑥图像分析将步骤⑤获得的凝胶染色，用扫描仪投射扫描，将得到的图像用ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ软件进行分析，得到蛋白相对含量的数据，找出明显的差异蛋白；⑦差异表达蛋白鉴定将差异蛋白在３７℃，用胰蛋白酶胶内酶切，通过质谱ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＴＯＦ，测定差异蛋白；（２）聚类分析：采用Ｅｘｐａｎｄｅｒ４．０对步骤（１）⑥中得到的数据进行标准化后，进行Ｋ－ｍｅａｎｓ聚类，得到具有不同变化规律的数据类别，获得候选差异蛋白；（３）过程分析将步骤（２）获得的候选差异蛋白含量按照时间序列制成图表，观察并分析这些蛋白变化的规律，进而发现其在维生素Ｃ工业混菌发酵过程中的作用。...
【技术特征摘要】
1. 一种检测维生素C工业混菌发酵过程中细胞内蛋白质变化方法，其特征是包括如下步骤(1)对维生素C发酵过程中所用的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和氧化葡糖杆菌(GluconcAacter oxydans)细胞内的蛋白质进行测定①细胞收集及淬灭将所述巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌进行发酵，在发酵过程中选3-5个时间点，所述时间点位于所述发酵过程的前期、中期和后期，在所述时间点快速取出发酵液样品，离心， 收集下层的细胞，并用磷酸盐缓冲液清洗，立即用液氮淬灭，终止代谢反应；用液氮研磨用于破碎细胞，获得3-5份破碎细胞；②提取细胞内蛋白取步骤①获得的3-5份破碎细胞100 200mg分别置于离心管中，加入0. 5 2ml细胞裂解液，混勻，冰上间歇超声破碎20 50s;加入5 15μ L的质量比为2 4 1的 DNase I/RNaseA酶混合溶液，混勻，4°C静置反应10 30min ；加入5 15 μ L 80 120mM 的苯甲基磺酰氟异丙醇溶液，4°C静置1 汕；15000rpm离心25 40min ；取上清，加4 6倍体积的_20°C _40°C的丙酮，沉淀12 20h ；离心，弃上清，沉淀用_20°C _40°C的体积浓度为70% -85%的丙酮水溶液洗涤；冷冻干燥备用；③蛋白浓度测定将牛血清蛋白由低浓度到高浓度加入考马斯亮蓝G-250溶液中，测定蛋白在595nm处的吸光值，建立标准曲线；将步骤②获得的蛋白分别溶于300μ L溶胀液中，测定蛋白浓度； 并分别按500 1000 μ g分装，-80°C贮存，所述溶胀液为8mol -L-I尿素，质量浓度为2% 的CHAPS，体积百分浓度为0. 5%的IPG buffer，余量为水；④一维等电聚焦电泳采用胶内泡胀上样法，将步骤③获得的各个500 IOOOyg蛋白样品溶液用溶胀液补齐至350 μ L，加入1. 0 1. 5mg 二硫苏糖醇，均勻铺于胶槽内，放入IPG干胶条，覆...
【专利技术属性】
技术研发人员：元英进，马倩，米造吉，谢萍，
申请(专利权)人：天津大学，河北维尔康制药有限公司，
类型：发明
国别省市：12
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