促红细胞生成素:促红细胞生成素的重构和糖缀合制造技术

包含一个或多个聚糖的ＥＰＯ肽，在该肽上共价附着有糖缀合分子。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术包括以这样的方式在体外向糖肽分子添加糖和/或从糖肽分子中删除糖的方法和组合物，从而提供具有特定定制的或想要的糖基化模式的肽分子，优选地包括在其上添加修饰的糖。因此本专利技术的一个关键特征是获取由任何细胞类型产生的肽并在该肽上生成核心聚糖结构，随后将聚糖结构在体外进行重构以生成具有适合于在哺乳动物中的治疗应用的糖基化模式的肽。肽的糖基化模式的重要性是本领域中众所周知的，正如现有的生产适当糖基化的肽的体内方法的局限性也是众所周知的，特别是当这些肽用重组DNA方法生产时。此外，直到本专利技术，尚不可能生成在其上具有想要的聚糖结构的糖肽，其中该肽可在工业规模上生产。在本专利技术中，将由细胞产生的肽在体外通过系统地添加适当的酶及其底物而进行酶处理，从而不应该存在于肽上的糖部分可被去除，而应该添加到肽上的糖部分(可选择地包括修饰的糖)则以这样的方式添加到肽上，从而提供具有如在别处所定义的“想要的糖基化”的糖肽。A.重构N-连接聚糖的方法在一方面，本专利技术利用如下事实，即大多数具有商业意义或药物意义的肽包含共同的在此处称为三甘露糖核心的五糖结构，该结构与肽链上Asn-X-Ser/Thr序列中的天冬酰胺进行N-连接。基本的三甘露糖核心基本由附着到肽上的2个N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和3个甘露糖(Man)残基组成，即它包含这5个糖残基而无额外的糖，例外是它可选择地可包括一个岩藻糖残基。第一个GlcNAc附着到天冬酰胺的酰胺基团上，而第二个GlcNAc通过β1，4-键附着到第一个上。1个甘露糖残基通过β1，4-键附着到第二个GlcNAc上，且2个甘露糖分别通过α1，3和α1，6键附着到该甘露糖上。对三甘露糖核心结构的示意性描述显示于图1左边。尽管大多数肽上的聚糖结构包含除三甘露糖核心之外的其他糖，但三甘露糖核心结构代表了哺乳动物肽上N-连接的聚糖的基本特征。本专利技术包括生成以三甘露糖核心结构作为在其上含有的聚糖分子的基本结构元件的肽。假定有各种用于生产肽的细胞系统，不管该系统本身是天然存在的还是涉及重组DNA方法学的，本专利技术均提供了使在任何细胞类型中产生的肽上的聚糖结构可还原为基本的三甘露糖核心结构的方法。一旦生成了基本的三甘露糖核心结构，那么可能的是利用在此处描述的方法在体外生成肽上想要的聚糖结构，该结构赋予该肽一种或多种增强其治疗功效的性质。从此处的讨论中可以看出术语“三甘露糖核心”用于描述在图1左边所示的聚糖结构。具有三甘露糖核心结构的糖肽也具有在其上添加的额外的糖，且在极大程度上，具有在其上添加的额外结构，而不管该糖是否使肽具有想要的聚糖结构。术语“基本的三甘露糖核心结构”在别处定义。当术语“基本的”不包括于“三甘露糖核心结构”的描述中时，那么该聚糖包含在甘露糖上附着有额外的糖的三甘露糖核心结构。术语“基本的三甘露糖核心糖肽”在此处用于指具有主要包含基本的三甘露糖核心结构的聚糖结构的糖肽。然而，它也可选择地含有在其上附着的岩藻糖残基。如在此处所讨论的，基本的三甘露糖核心糖肽是最适的，且因此是优选的用于本专利技术的聚糖重构过程的起始材料。另一种最适的用于本专利技术的聚糖重构过程的起始材料是具有三甘露糖核心的聚糖结构，其中一个或多个额外的GlcNAc残基添加到甘露糖残基的α1，3和α1，6的每一个上(参见如图2中第二条线上的结构，从图的左边起第二个结构)。该结构在此处称为“Man3GlcNAc4”。当该结构为单触角时，该结构在此处称为“Man3GlcNAc3”可选择地，该结构也可含有核心岩藻糖分子。一旦生成了Man3GlcNAc3或Man3GlcNAc4结构，那么可能的是利用在此处描述的方法在体外生成肽上想要的聚糖结构，该结构赋予该肽一种或多种增强其治疗功效的性质。在其天然形式中，本专利技术N-连接的糖肽，特别是用于本专利技术的哺乳动物和人类的糖肽是用在其上附着一个或多个糖的三甘露糖核心结构进行N-连接糖基化的。术语“糖肽”和“糖多肽”在此处同义地用于指具有在其上附着的糖部分的肽链。在此处对小的糖多肽或糖肽与大的糖多肽或糖肽未作区分。因而，在其肽链中具有非常少的氨基酸(如常少至3个氨基酸)的激素分子和其他非常大的肽均包括于通用术语“糖多肽”和“糖肽”中，只要它们具有在其上附着的糖部分。然而，术语“肽”的使用不排除该肽为糖肽。具有想要的糖基化的N-连接糖肽的例子是具有N-连接的聚糖的肽，该聚糖具有在其上附着至少一个GlcNAc残基的三甘露糖核心。该残基是用N-乙酰葡糖胺转移酶I(GnT-I)添加到三甘露糖核心上的。如果添加第二个GlcNAc，则应用N-乙酰葡糖胺转移酶II(GnT-II)。可选择地，可用GnT-IV和/或GnT-V添加额外的GlcNAc残基，且第三个等分的GlcNAc残基可用N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnT-III)附着到三甘露糖核心的β1，4甘露糖上。可选择地，该结构可用β1，4半乳糖基转移酶处理进行延伸以向每一个非等分的GlcNAc上添加半乳糖残基，且进一步可选择地，利用α2，3或α2，6-唾酸转移酶可将唾液酸残基添加到每一个半乳糖残基上。等分的GlcNAc向聚糖的添加不是随后添加半乳糖和唾液酸残基所必需的；然而，对于大鼠和人类GnT-III酶的底物亲和力，聚糖上一个或多个半乳糖残基的存在排除了等分的GlcNAc的添加，这是因为含有半乳糖的聚糖不是这些形式的GnT-III的底物。因而，在等分的GlcNAc想要存在和应用这些形式的GnT-III的情况下，重要的是如果聚糖含有添加的半乳糖和/或唾液酸，那么它们应该在添加等分的GlcNAc之前去除。其他形式的GnT-III的活性可能不需要这种特定的底物顺序。在更优选的反应中，将GnT-I、GnT-II和GnT-III的混合物加入到反应混合物中，从而GlcNAc残基可以以任何顺序添加。代表具有“想要的糖基化”的肽的各个方面的聚糖结构的例子在此处提供的附图中显示。体外生成具有“想要的糖基化”的肽的精确过程在别处描述。然而，本专利技术决不应该解释为只是局限于在此处公开的任何一个聚糖结构。本专利技术更合适地应该解释为包括可用在此处提供的方法制备的任何一个或全部的聚糖结构。在一些情况下，基本的三甘露糖核心单独可构成肽的想要的糖基化。例如，已显示仅具有三甘露糖核心的肽是用于治疗高歇病的酶的有用成分(Mistry等人，1966，Lancet 3481555-1559；Bijsterbosch等人，1966，Eur.J.Biochem.237344-349)。根据本专利技术，下面描述生成具有想要的糖基化的肽的程序。a)起始于具有一个或多个聚糖分子的糖肽，该聚糖分子的共同特征为具有三甘露糖核心结构和在其上添加的一个或多个糖的至少一种或多种异质的或同质的混合物，可能的是增加具有基本的三甘露糖核心结构作为唯一聚糖结构的或具有Man3GlcNAc3或Man3GlcNAc4作为唯一聚糖结构的糖肽的比例。这是在体外通过以适当的顺序系统地向糖肽添加适当数目的酶而实现，该酶可切割聚糖结构上的糖的异质的或同质的混合物直到其减少到基本的三甘露糖核心或Man3GlcNAc3或Man3GlcNAc4结构。这些如何实现的特定例子将依赖于各种因素，在很大部分上包括产生肽的细胞类型及因此在最初由细胞产生的肽上存在的聚本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.包含一个或多个聚糖的EPO肽，在该肽上共价附着有糖缀合分子。2.权利要求1的EPO肽，其中该一个或多个聚糖是单触角聚糖。3.权利要求1的EPO肽，其中该一个或多个聚糖是双触角聚糖。4.权利要求1的EPO肽，其中该一个或多个聚糖是三触角聚糖。5.权利要求1的EPO肽，其中该一个或多个聚糖至少是三触角聚糖。6.权利要求1的EPO肽，其中该一个或多个聚糖包含至少两个聚糖，所述至少两个聚糖含有混合的单或多触角聚糖。7.权利要求1的EPO肽，其中该一个或多个聚糖选自N-连接的聚糖和O-连接的聚糖。8.权利要求1的EPO肽，其中该一个或多个聚糖是至少两个选自N-连接的和O-连接的聚糖的聚糖。9.权利要求1的EPO肽，其中该肽表达于选自原核细胞和真核细胞的细胞中。10.权利要求9的EPO肽，其中该真核细胞选自哺乳动物细胞、昆虫细胞和真菌细胞。11.权利要求10的EPO肽，其中该真菌细胞是酵母细胞。12.包含EPO肽和至少一个聚糖和至少一个共价附着于该聚糖的聚乙二醇分子的糖PEG化的EPO肽，其中该聚乙二醇分子是应用糖基转移酶添加到该EPO肽上的。13.权利要求12的糖PEG化的EPO肽，包含至少一个单触角聚糖。14.权利要求12的糖PEG化的EPO肽，其中所有该聚糖是N-连接的和单触角的。15.权利要求12的糖PEG化的EPO肽，其中所有该聚糖是N-连接的，且至少一个该聚糖包含所述聚乙二醇。16.权利要求15的糖PEG化的EPO肽，其中超过一个该聚糖包含所述聚乙二醇。17.权利要求12的糖PEG化的EPO肽，其中所有该聚糖是N-连接的，且所有该聚糖包含所述聚乙二醇。18.权利要求12的糖PEG化的EPO肽，包含至少3个在其上共价附着有所述聚乙二醇的单触角聚糖。19.糖PEG化的EPO肽，其中该EPO肽包含3个或更多聚糖。20.权利要求9的糖PEG化的EPO肽，其中至少一个该聚糖包含在其上共价附着的所述聚乙二醇。21.权利要求18的糖PEG化的EPO肽，其中超过一个该聚糖包含在其上共价附着的所述聚乙二醇。22.权利要求18的糖PEG化的EPO肽，其中所有该聚糖包含在其上共价附着的所述聚乙二醇。23.权利要求12的糖PEG化的EPO肽，其中所述聚乙二醇连接到至少一个选自岩藻糖(Fuc)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖(Gal)和唾液酸(SA)的糖部分上。24.权利要求23的糖PEG化的EPO肽，其中该唾液酸是N-乙酰神经氨酸。25.权利要求12的糖PEG化的EPO肽，其中该EPO肽不包含O-连接的聚糖。26.权利要求12的糖PEG化的EPO肽，其中该EPO肽包含至少一个O-连接的聚糖。27.权利要求26的糖PEG化的EPO肽，其中该O-连接的聚糖包含在其上共价附着的所述聚乙二醇。28.权利要求27的糖PEG化的EPO肽，其中该EPO肽是在细胞中重组表达的。29.权利要求28的糖PEG化的EPO肽，其中该细胞选自昆虫细胞、真菌细胞和哺乳动物细胞。30.权利要求29的糖PEG化的EPO肽，其中该真菌细胞是酵母细胞。31.权利要求29的糖PEG化的EPO肽，其中该细胞是昆虫细胞。32.权利要求29的糖PEG化的EPO肽，其中该细胞是酵母细胞。33.权利要求29的糖PEG化的EPO肽，其中该细胞是哺乳动物细胞。34.权利要求33的糖PEG化的EPO肽，其中该哺乳动物细胞是CHO细胞。35.权利要求12的糖PEG化的EPO肽，其中该聚乙二醇具有选自约1kDa、2kDa、5kDa、10kDa、20kDa、30kDa和40kDa的分子量。36.权利要求35的糖PEG化的EPO肽，其中该聚乙二醇具有20kDa的分子量。37.权利要求12的糖PEG化的EPO肽，其中该EPO肽选自天然存在的EPO肽和突变的EPO肽。38.权利要求37的糖PEG化的EPO肽，其中该突变的EPO肽包含具有至少一个选自Arg139到Ala139、Arg143到Ala143和Lys154到Ala154的突变的氨基酸序列SEQ ID NO73。39.制备糖PEG化的EPO肽的方法，该方法包含以下步骤(a)使EPO肽与包含共价连接到聚乙二醇的核苷酸糖和糖基转移酶的混合物在足以将该聚乙二醇转移到该EPO肽上的条件下接触。40.权利要求39的方法，其中该核苷酸糖的糖选自岩藻糖(Fuc)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖(Gal)和唾液酸(SA)。41.权利要求40的方法，其中该唾液酸是N-乙酰神经氨酸(NAN)。42.权利要求39的方法，其中该聚乙二醇具有选自约1kDa、2kDa、5kDa、10kDa、20kDa、30kDa和40kDa的分子量。43.权利要求4...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·德弗里斯，D·佐普夫，R·拜尔，C·博维，D·海克斯，陈希，
申请(专利权)人：尼奥斯技术有限公司，
类型：发明
国别省市：