鱼肉制品中安康鱼种源的检测方法技术

本发明专利技术属于鱼肉制品中物种来源鉴定的检测技术，具体地说是用实时荧光ＰＣＲ技术检测食品中安康鱼的快速检测方法。方法包括ＰＣＲ扩增反应液和上游引物ＡｎｋａｎｇＦ１０６：５－ＴＴＴＡＴＴＣＧＴＡＴＧＧＧＣＴＧＴＴ－３、下游引物ＡｎｋａｎｇＲ１０６：５－ＧＧＴＧＴＴＴＡＧＧＴＴＴＡＧＧＴＣＴ－３；安康鱼的快速检测方法包括鱼肉制品ＤＮＡ的提取、安康鱼种属特异性基因的实时荧光ＰＣＲ扩增和使用熔解曲线进行结果判定。其优点是快速、特异性强、灵敏度高、操作简便。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于鱼肉制品中物种来源鉴定的检测技术，具体地说是用实时荧光PCR技术检测食品中安康鱼的快速检测方法。
技术介绍
海洋捕捞的海洋大型鱼类一直是世界各国人民喜爱的食品，也是国际贸易的重要商品种类。海洋大型鱼类在贸易中常常包括加工成鱼肉片或者鱼肉块，更包括一些鱼的内脏或者其他深加工的产品。这些产品从外观上已经不能看出用来加工的原料鱼种类，因此需要不受外观和加工工艺的限制来确认商品的真伪。基于DNA的检测方法可以从基因水平进行物种鉴定。实时荧光PCR法以其操作简便、灵敏、特异、快速、重复性好、定量准确、全封闭反应等优点，得到研究者的普遍认可，成为基因检测和鉴定的重要工具。目前国内外还没有对安康鱼物种的鉴定方法公开，本专利技术可弥补上述缺陷，完成鱼肉制品中安康鱼种源的鉴定。
技术实现思路
本专利技术属于鱼肉制品中物种来源鉴定的检测技术，具体地说是用实时荧光PCR技术检测食品中安康鱼的快速检测方法。克服基于形态学的检测方法在鱼类产品加工过程中带来的鉴定困难，为确定安康鱼的种源提供技术手段，从而确保食品标签的一致性。本专利技术的主要原理为：针对保守序列设计一组引物：上游引物AnkangF106：5-TTTATTCGTATGGGCTGTT-3；下游引物AnkangR106：5-GGTGTTTAGGTTTAGGTCT-3。利用裂解液破碎细胞，三氯甲烷抽提蛋白质，异丙醇沉淀得到DNA；以提取的DNA为模板进行PCR扩增；测定熔解曲线时，在反应体系中加入荧光染料Eva Green，染料与DNA双链结合并发出荧光，由于反应中存在少量的非特异聚合体(如引物二聚体等)，能引起干扰，但非特异聚合体的熔解温度较特异性结合低，当扩增结束后，再缓慢加温，当DNA变性后，染料被释放，荧光减少，而非特异性结合先于特异性结合减少，对熔解过程进行连续动态监测可得熔解曲线，通过曲线将非特异性讯号和特异性讯号区分出来，同时对特异性讯号区，荧光减少的快慢与浓度的对数成正比，以此可以确定是否有引物特异性扩增产物。本专利技术涉及的安康鱼种源快速检测方法，其中的试剂包括如下：(1)PCR扩增反应液包括10×PCR反应缓冲液、0.1-0.4mmol/L dNTP、2-4mmol/L硫酸镁、1-2U Taq酶、0.2-0.6μmol/L上游引物、0.2-0.6μmol/L下游引物、1.25μL 20×Eva Green染料(美国Biotum公司)；其中10×PCR反应缓冲液含有100mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、500mmol/L氯化钾和1％曲拉通X-100；上游引物AnkangF106：5-TTTATTCGTATGGGCTGTT-3；下游引物AnkangR106：5-GGTGTTTAGGTTTAGGTCT-3。其中上游引物、下游引物体积比为：1∶1；-->使用上述试剂盒检测食品中安康鱼种源的方法，依次包括下列步骤(1)-(3)：(1)待检样品DNA的提取DNA提取可采用普通酚-氯仿抽提法或使用DNA提取试剂盒。DNA提取质量使用OD260和OD280的光吸收来衡量，或者使用其他方法衡量。(2)安康鱼种源的实时荧光PCR扩增A.在装有24μL PCR扩增反应液A的反应管中加入1μL待检样品DNA，混匀。B.检测过程中分别设阳性对照、空白对照。使用具有溯源性的阳性标准物质作为阳性对照，用已知不含鱼类成分的样品作阴性对照，用等体积的水代替模板DNA作空白对照。C.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：94-95℃  2-4min，1个循环；94-95℃  30s，65℃ 30s，75℃ 30s，共45个循环；95℃ 15s，60℃ 15s，20min内升温至95℃，95℃ 15s。(3)使用熔解曲线分析PCR扩增结果。非安康鱼样品：熔解曲线在81±0.5℃无单一峰；安康鱼样品：熔解曲线在81±0.5℃有单一峰。本专利技术建立了安康鱼种源的实时荧光PCR检测方法及检测方法。本专利技术采用实时荧光PCR技术，该技术特异性强、灵敏度高、操作简便，特别适用于一些成分复杂的鱼肉制品中安康鱼种源的检测。附图说明图1是实施例1中安康鱼样品PCR产物的熔解曲线图。图中的单一峰分别为安康鱼阳性标准品和待检样品的熔解曲线。没有出峰的线是空白对照。图2是实施例2中安康鱼样品PCR产物的熔解曲线图。图中的单一峰分别为安康鱼阳性标准品的熔解曲线。没有出峰的线是待检样品和空白对照。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步说明。实施例1按下述方法检测市售安康鱼：包括10×PCR反应缓冲液、0.2mmol/L dNTP、2mmol/L硫酸镁1.5U Taq酶、0.4μmol/L上游引物AnkangF106：5-TTTATTCGTATGGGCTGTT-3；下游引物AnkangR106：5-GGTGTTTAGGTTTAGGTCT-3。其中10×PCR反应缓冲液含有100mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、500mmol/L氯化钾和1％曲拉通X-100；按照以下程序进行检测：(1)待测鱼肉样品DNA的提取A.称取0.5g鱼肉，剪碎，转至1.5mL离心管中。加入500μL抽提裂解缓冲液(0.05M Tris-HCL(三羟基甲基氨基甲烷-盐酸)、0.1M EDTA(乙二胺四乙酸)、0.2M氯化-->钠、pH值7.6灭菌双蒸水)，充分振荡；B.加入蛋白酶K 60μL，10％SDS 2μL，颠倒混匀。57℃水浴10h至原料消化为清液，4000rpm离心2min，取上清；C.加入500μL等体积的Tris-酚，颠倒混匀10min，12000rpm离心10min，取上清；D.重复上步；E.在上清液中加入Tris-酚、氯仿和异戊醇(体积比为25∶24∶1)，颠倒混匀10min，12000rpm离心10min，取上清；F.在上清液中加入氯仿和异戊醇(体积比为24∶1)，颠倒混匀10min，12000rpm离心10min，取上清；G.加入两倍体积无水乙醇，1/5体积的醋酸钠(4M)，颠倒混匀10min，沉淀DNA；12000rpm离心10min，弃上清；H.加入600μL乙醇(70％)洗涤DNA，离心弃上清，开盖，晾干；I.加入100μL灭菌双蒸水溶解DNA。J.DNA提取质量：纯度OD260/OD280＝1.83，浓度为101ng/μL。满足PCR反应的条件。(2)待测鱼片DNA的实时荧光PCR扩增A.在PCR反应管中加入24μL PCR反应液A和1μL样品DNA，混匀。B.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：94-95℃  2-4min，1个循环；94-95℃  10-60s，65℃ 10-60s，75℃ 10-60s，共45个循环；95℃ 15s，60℃ 15s，20min内升温至95℃，95℃ 15s。(3)应用荧光定量PCR仪随机软件，分析熔解曲线结果。非安康鱼样品：熔解曲线在81±0.5℃无单一峰；安康鱼样品：熔解曲线在81±0.5℃有单一峰。实施例2按下述方法检测市售鱼内脏是否为安康鱼来源：包括10×PCR反应缓冲液、0.2mmol/L dNTP、2mmol/L硫酸镁1.5U Taq本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种安康鱼物种鉴定的快速检测方法，其特征在于其中的引物：上游引物ＡｎｋａｎｇＦ１０６：５－ＴＴＴＡＴＴＣＧＴＡＴＧＧＧＣＴＧＴＴ－３；下游引物ＡｎｋａｎｇＲ１０６：５－ＧＧＴＧＴＴＴＡＧＧＴＴＴＡＧＧＴＣＴ－３。

【技术特征摘要】
1.一种安康鱼物种鉴定的快速检测方法，其特征在于其中的引物：上游引物AnkangF106：5-TTTATTCGTATGGGCTGTT-3；下游引物AnkangR106：5-GGTGTTTAGGTTTAGGTCT-3。2.一种使用权利要求一所述的快速鉴定安康鱼物种的检测方法，其特征是依次包括下列步骤：(1)待检样品的DNA提取；(2)安康鱼CO I基因的实时荧光PCR扩增：...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘畅，
申请(专利权)人：刘畅，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]