一种高产油酸的丝状真菌工程菌株的构建方法技术

本发明专利技术涉及一种高产油酸的丝状真菌工程菌株的构建方法，反义千年桐ＶｅＦＡＤ２基因构建在表达载体ｐＢＩ１２１质粒上，以ｐＢＩ１２１为基本骨架，将千年桐ＶｅＦＡＤ２基因反向连接在该载体上，采用农杆菌介导法将ＶｅＦＡＤ２基因反向转入少根根霉后，可以改变脂肪酸成分提高油酸含量。该方法的步骤如下：（１）含酶切位点千年桐ＶｅＦＡＤ２基因ｃＤＮＡ编码区全长序列获得；（２）ＶｅＦＡＤ２反义表达载体构建；（３）农杆菌转化子的获得；（４）少根根霉工程菌株的获得。本发明专利技术有益的效果是：本发明专利技术将从千年桐种子总ＲＮＡ中分离的ＶｅＦＡＤ２基因构建到表达载体ｐＢＩ１２１上，并采用农杆菌介导法将ＶｅＦＡＤ２基因反向导入少根根霉，使植物脂肪酸合成基因在酵母中高效表达，提高了油脂中油酸的含量。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种高产油酸的丝状真菌工程菌株的构建方法，其特征是：在丝状真菌基因组中含有千年桐ＶｅＦＡＤ↓［２］基因表达盒，该表达盒依次含有ＣａＭＶ３５Ｓ启动子、千年桐ＶｅＦＡＤ↓［２］序列、终止密码子，所述的丝状真菌是少根根霉；该方法的步骤如下：（１）、含酶切位点千年桐ＶｅＦＡＤ↓［２］基因ｃＤＮＡ编码区全长序列获得根据千年桐ＶｅＦＡＤ↓［２］基因核苷酸序列设计引物，以千年桐未成熟种子总ＲＮＡ为模板，经ＲＴ－ＰＣＲ扩增，在ＶｅＦＡＤ↓［２］上游引入ＸｂａｌⅠ酶切位点，下游引入ＢａｍＨⅠ酶切位点，电泳回收ＶｅＦＡＤ↓［２］基因ｃＤＮＡ片段，克隆到ｐＧＥＭ　Ｔ－Ｅａｓｙ载体，转化大肠杆菌ＤＨ５α，测序，命名该载体为ｐＧＥＭ－Ｔ－Ｖｅｆａｄ２；（２）、ＶｅＦＡＤ↓［２］反义表达载体构建结合表达载体ｐＢＩ１２１的限制性酶切位点图谱，选用ＸｂａｌⅠ和ＢａｍＨⅠ两个位置来作为插入目的片段的酶切位点，设计带ＸｂａｌⅠ和ＢａｍＨⅠ酶切位点的引物，以克隆载体质粒ｐＧＥＭ－Ｔ－ＸＢｆａｄ２为模板进行ＰＣＲ反应；将扩增产物与表达载体ｐＣＡＭ２３００一起均用ＸｂａｌⅠ和ＢａｍＨⅠ双酶切；分别回收相应的片段，用Ｔ↓［４］ＤＮＡ连接酶进行连接，转化Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ　５α感受态细胞。提取质粒进行酶切鉴定。表达载体命名为ｐＢＩ－ｆａｄ２；（３）农杆菌转化子的获得采用冻溶法将重组表达载体ｐＢＩ－ｆａｄ２农杆菌菌株ＥＨＡ１０５、ＡＧＬ－１；（４）少根根霉转化子的获得采用农杆菌介导法将ＶｅＦＡＤ↓［２］反向导入少根根霉基因组，获得了转千年桐ＶｅＦＡＤ↓［２］基因的少根根霉工程菌株。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李纪元，范正琪，刘明靖，田敏，吴开云，李辛雷，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院亚热带林业研究所，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]