积雪草酸在制备药物方面的用途制造技术

本发明专利技术公开了积雪草酸在制备药物方面的新用途，特别是在制备抗肝纤维化药物方面的用途。研究表明，积雪草酸确实在抗肝纤维化方面有着良好的药效作用，积雪草酸确实可以用于制备抗肝纤维化方面的药物。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及积雪草酸在制备药物方面的用途，特别是涉及积雪草酸在制备抗肝纤维化药物方面的用途。
技术介绍
积雪草为伞形科积雪草属植物，广泛分布于长江流域以南各地。全草入药。在我国积雪草外用及内服治病已有两千多年历史。其具有清热利湿，解毒消肿之功能。适用于湿热黄疸，中暑腹泻，砂淋血淋，痈肿疮毒，跌扑损伤。积雪草的化学成分以三萜类为主，如积雪草苷、羟基积雪草苷等五环三萜型酯苷。积雪草还含有三萜酸类，如积雪草酸、羟基积雪草酸等。此外，积雪草中还有少量的多炔烯类、挥发油类、香草酸等。积雪草酸是一种已知物质。购自美国SIGMA公司的积雪草酸为高效液相色谱技术提取物，黄棕色粉末，无臭，味苦。分子式为C48H78O5，分子量为488.70道尔顿(D)，熔点为325℃-330℃，不溶于水，溶于二甲亚砜。其分子结构式如下式所示 肝纤维化是各种慢性肝病向肝硬化发展过程中的一个病例过程，其主要机理是肝星状细胞活化并转化为成纤维细胞，产生大量以胶原纤维为主要成分的细胞外基质，使肝组织结构逐渐改变，肝功能不断下降的病理过程。转化生长因子β(TGFβ)的信号经过细胞内的Smad信号转导促使纤维化相关的基因的表达，TGFβ/Smad信号途径最主要的肝纤维化信号途径，TGFβ与肝星状细胞(HSC-T6)TGFβ受体结合后，使Smad2/3磷酸化，并与Smad4结合进入细胞核，启动肝肝星状细胞(HSC-T6)纤维蛋白相关基因的转录。Smad7是TGFβ信号途径的负反馈调节因子，可以抑制Smad2/3磷酸化，进而抑制肝纤维化。在病理条件下，TGFβ信号持续使Smad2/3磷酸化，导致纤维蛋白基因的转录和蛋白合成。本专利技术的过程证明积雪草酸可抑制大鼠肝星状细胞(HSC-T6)活化和转化，使alpha肌动蛋白(alpha-SMA)表达下降。同时，本专利技术的过程证明积雪草酸可抑制大鼠肝星状细胞胶原蛋白合成，从而抑制肝纤维化。本专利技术的过程还证明积雪草酸抑制肝胶原蛋白合成通过上调Smad7負反馈信号发挥对TGFβ/Smad信号转导的抑制作用。肝纤维化是一个可逆的过程，在肝纤维化阶段采取积极的治疗措施对防止肝硬化是至关重要的。目前西药抗肝纤维化的治疗尚缺乏理想的药物。积雪草酸是一种有显著地抗肝纤维化作用的药物。肝星状细胞约占所有肝细胞总数的15％。在致肝纤维化因素的作用下，肝星状细胞分泌大量细胞外基质，基质主要由纤维蛋白和由肝星状细胞活化和转化而来的成纤维细胞组成。大鼠肝星状细胞(HSC-T6)细胞系是研究肝纤维化的细胞模型，由美国Friedman SL(Division of Liver Diseases，Mount SinaiSchool of Medicine，New York，USA)教授建立并惠赠。文献资料报道，积雪草酸的公知药物用途有用其制备愈合皮肤伤口、治疗瘢痕疙瘩的药物，以及制备防治心血管疾病、防治脑血管疾病的药物。至今，国内外有关积雪草酸在抗肝纤维化方面的研究均缺乏有说服力的实验证据表明积雪草酸确实能够抗肝纤维化。积雪草酸在制备抗肝纤维化药物方面的用途至今未见报导。而我们专利技术积雪草酸在制备抗肝纤维化药物方面的新用途完全是建立在充分和有说服力的实验证据基础之上的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供积雪草酸在制备抗肝纤维化药物方面的新用途。本专利技术提供积雪草酸在制备抗肝纤维化药物方面的用途。为此，通过实验要证明1、积雪草酸抑制TGFβ诱导的大鼠肝星状细胞活化和转化，使alpha-SMA蛋白表达减少。2、积雪草酸抑制TGFβ诱导的大鼠肝星状细胞胶原蛋白合成。3、积雪草抑制胶原蛋白合成的机理是上调TGFβ/Smad信号途径中Smad7負反馈信号。以下为整个实验过程材料方法1.细胞培养HSC-T6维持培养在低糖型DMEM(Invitrogen)培养基中，添加1％青链霉素(Invitrogen)和10％胎牛血清(Hyclone).每孔1×104细胞2.5ml铺6孔培养板，24小时后，换含0.2％胎牛血清DMEM培养24小时，加AA(5μM，10μM，20μM，30μM，)达2小时，加1ng/ml TGFβ，设立各组对照，24小时后从细胞提取蛋白或mRNA。2.蛋白质提取将各孔细胞的培养基弃去，用预冷的0.01M PBS冲洗2次。六孔板每孔加250uL RIPA细胞蛋白裂解液，摇晃使其充分覆盖底部，冰上放置30min。RIPA蛋白裂解缓冲液的成分为1％Nonidet P-40，0.1％SDS，1mM PMSF，0.5％sodium deoxycholate，1mM sodium orthovanadate，10mM sodium fluoridein PBS。细胞刮子刮取细胞，收集至1.5mL Eppendorf管中。在冰上对样本进行超声粉碎，500W、3s×6次，4℃、12000rpm离心10min，取上清。储存于-70℃备用。3.信使核糖核酸(mRNA)抽提将各孔细胞的培养基弃去，用PBS缓冲液冲洗后在十二孔板的每个孔中加入350uL含有β2-巯基乙醇的RLT裂解液。轻轻摇晃使裂解液与细胞充分接触后收集标本到1.5mL离心管中，按照QIAGEN公司RNeasy Mini Kit(Cat 74104)的说明书进行提取细胞的总RNA。4.聚合酶链反应(PCR)逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)取质量为1.5ug的总RNA以Oligo(dT)为引物合成第一链cDNA(按试剂盒说明书进行)，反应试剂10X PCR Buffer 2.0μL，50mMMgCl22.0μL，10mMdNTPs 2.0μL，Oligo (dT)12-181.0μL，Rnase Inhibitor 1.0μL，M-MLV0.25μL，H2O 9.75μL，RNA 2.0μL，Total Volume 20μL.反应条件22℃10minutes，42℃15minutes，99℃ 5minutes，将cDNA-20℃保存备用。实时定量聚合酶链反应(Real-Time PCR)引物的序列如下RatSmad7FCGCTGTACCTTCCTCCGAT RatSmad7RAGAAGATATCCAGGGAGGGCTCTTReal-Time PCR反应试剂2×iQ SYBR Green Supermix 10μL，H2O 7.2μL，Primer-10.4μL，Primer-20.4μL，DNA 2μL，反应条件94℃，5min，循环条件94℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸42s。共扩增40个循环，最后一个循环后置72℃孵育5min。5.免疫印记(Western blot)试剂0.5M Tris-HCl，PH6.8，1.5M Tris-HCl PH8.8；40％Acrylamide/BisSolution；20×NuPAGE MES SDS电泳缓冲液；20×NuPAGE转膜缓冲液；PVDF膜；X-感光胶片；ECL(super signal west pico stable peroxide solution)；ECL plus(Lumigen PS-3Detection Reagent Solution)；4％积层胶，10％分离胶，总蛋白20ug的样本；非连续SDS-PAG本文档来自技高网...

【技术保护点】
积雪草酸在制备抗肝纤维化药物方面的用途。

【技术特征摘要】
1.积雪草酸在制备抗肝纤维化药物方面的用途。2.根据权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭家驹，汤丽霞，杨光，蓝辉耀，
申请(专利权)人：佛山市第一人民医院，
类型：发明
国别省市：44[中国|广东]