新的G-CSF轭合物制造技术

本申请涉及新的ＰＥＧ－Ｇ－ＣＳＦ轭合物，在其中ＰＥＧ分子连接天然Ｇ－ＣＳＦ基本序列１７位半胱氨酸残基或Ｇ－ＣＳＦ类似物相应位置的半胱氨酸残基。本申请还描述生产这种轭合物的方法，这种方法包括以下步骤：（ｉ）使Ｇ－ＣＳＦ蛋白质经受诱导蛋白质可逆变性的条件，（ｉｉ）在步骤ｉ得到的变性的蛋白质与巯基－活性ＰＥＧ在变性的条件下轭合，（ｉｉｉ）使在步骤ｉｉ得到的轭合物经受促进轭合物复性的条件，产生生物活性的Ｇ－ＣＳＦ－ＰＥＧ轭合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及粒细胞集落刺激因子(G-CSF)位点特异性的化学修饰。
技术介绍
粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，是体内粒细胞生成的主要调节因子，目前代表刺激粒细胞系增殖、分化和细胞存活的药物活性蛋白质。人类G-CSF是糖蛋白，大约20kDa大小，由骨髓中的巨噬细胞和基质细胞产生(Fibbe等人，1989 Interleukin 1 and poly(rI).poly(rC)induceproduction of granulocyte CSF，macrophage CSF，and granulocyte-macrophage CSF by human endothelial cells，Exp Hematol.，Mar 17(3)，229-34)，其首先由命名为5637的人类膀胱癌细胞系的条件培养液纯化(Welte等人，1985，Purification and biochemical characterizationof human pluripotent hematopoietic colony-stimulating factor，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，1526-1530)。编码人类G-CSF的DNA序列的确定(开放状态的日本专利申请KOHYO No.500636/88)使通过重组基因技术生产人类G-CSF成为可能。大肠杆菌(E.coli)表达的G-CSF不同于天然产物，因为它缺少糖基化并且随着细菌表达伴有N-末端的蛋氨酰(Lu等人，1989，Disulfide and secondary structure ofrecombinant human granulocyte colony-stimulating factor，Arch.Biochem.Biophys 268，81-92)。G-CSF的临床应用(综述于Nemunaitis J.，1997，A comparativereview of colony-stimulating factor，Drugs 54，709-729；Welte K.等人，1996，Filgrastim(r-metHuG-CSF)Thefirst 10 years，Blood88，1907-1929中)开始于1986年，在用化疗治疗的肿瘤病人中进行首次临床试验(Bronchud M.H.等人，1987，Phase I/II study ofrecombinant human granulocyte colony-stimulating factor inpatients receiving intensive chemotherapy for small cell lungcancer，Br.J.Cancer 56，809-813)，并且现在广泛用于治疗中性粒细胞减少症。中性粒细胞减少症发生在多种疾病背景中，包括先天缺陷、药物处理后的骨髓抑制、和感染。这种疾患在经历细胞毒化疗的癌症病人中也发生。中性粒细胞减少症能反过来引起通常需要住院的细菌感染和二次感染。G-CSF能缩短中性粒细胞减少症的时期或一起预防之。在1991年，美国食品与药物管理局批准了Neopogen(Filgrastin，rh-met-huG-CSF)用于化疗之中或之后遭受中性粒细胞减少症的那些病人。用G-CSF治疗能允许更高剂量强度的方案，其可能允许更好的抗肿瘤效果(Morstyn D.和Dexter T.M.，1994，Neupogen(r-metHuG-CSF)in Clinical Practice，Marcel Dekker，New York)。后来世界范围批准在骨髓移植中的应用并且更近期对严重的慢性先天性中性粒细胞减少症的治疗。Neopogen在用于移植的外周血祖细胞的动员中有潜在应用(Herman等人，1996，Characterisation，formulation，and stabilityof Neupogen(Filgrastim)，a recombinant human granulocyte-colonystimulating factor.，Pharm Biotechnol.9，303-28)。美国市场有80多种多肽药，并且另外350种正在进行临床试验。大约1/3在临床试验中的候选药品是多肽，但这些药品通常体内半衰期短。多种因素影响从循环系统除去肽，如蛋白裂解降解作用、肾脏过滤作用、以及免疫原性反应和抗原性反应。另外，多数多肽药品必须通过注射递送，或者皮下地或者静脉地，并且通常低溶解性也可能是问题。为克服这些不足，提议了一些方法，例如改变肽的氨基酸序列以降低被酶的降解和抗原性副作用，或者将它们与免疫球蛋白或白蛋白融合以改善半衰期，并且将它们掺入例如脂质体的递送载体。对于考虑G-CSF的，提交了开发这种方法的许多专利申请并且文章也发表了。我们引用在那些报道中基本序列中的变化美国专利No.5,214,132报道了人类G-CSF一种遗传变异体，其在1、3、4、5和17位与天然rhG-CSF不同，其中替代了天然的G-CSF氨基酸，突变蛋白相应替代为Ala、Thr、Tyr、Arg和Ser(参见Kuga等人1989，Mutagenesis of human granulocyte colony stimulating factor，Biochem.Biophys.Res.Commun.159，103-111)。M.Okabe等人(In vitro and in vivo hematopoietic effect ofmutant human granulocyte colony-stimulating factor，1990，Blood75(9)May 1，1788-1793)报道rhG-CSF的一种衍生物，其中rhG-CSF的N-末端区的5个位点的氨基酸被替代，其在两个分析中的小鼠和/或人的骨髓祖细胞中与完整的G-CSF相比显示更高的特异活性。美国专利No.5,218,092公布人类G-CSF一种遗传变异体，其在1、3、4、5、17、145和147位与天然rhG-CSF不同，其中替代了天然的G-CSF氨基酸，突变蛋白相应替代为Ala、Thr、Tyr、Arg、Ser、Asn和Ser。WO 01/04329-A报道了一种rhG-CSF突变蛋白，其在1、2、3或17位与天然rhG-CSF不同。WO 02/20766-A和02/20767-A公布了被组氨酸取代的G-CSF类似物的构成。WO 02/077034-A报道了有降低的免疫原性的修饰的G-CSF，通过移去一个或多个T-细胞表位或通过降低MHC同种异型的数量获得。用于降低蛋白清除率、增进蛋白稳定性或消除蛋白抗原性的替代方法是PEG化，其中蛋白质通过使用聚(乙二醇)链被化学修饰。当聚(乙二醇)(PEG)被合适地连接到多肽，它修饰其许多特征，同时例如酶活性或受体识别的许多生物功能可能被保留。PEG的轭合遮盖了蛋白质表面并且增加了多肽分子的大小，因此降低肾脏的超滤作用、阻止与抗体或抗原递呈细胞的接触并且减少被蛋白裂解酶的降解。最终，PEG将其物理化学的性质传递给分子，并且因此也修饰肽和非肽药物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＰＥＧ与人类Ｇ－ＣＳＦ或Ｇ－ＣＳＦ类似物的轭合物，其特征在于所述人类Ｇ－ＣＳＦ的１７位或所述Ｇ－ＣＳＦ类似物相应位置的半胱氨酸巯基与ＰＥＧ分子轭合。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：FM韦罗内塞，M伯纳，
申请(专利权)人：尼克塔治疗公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]