使用siRNA 组合进行疾病治疗和在RNAi中提高siRNA效力的方法技术

本发明专利技术提供了一种用于治疗疾病或病症的方法和一种提高ＲＮＡｉ效力的方法。本发明专利技术还提供了用于治疗疾病或病症以及用以提高ｓｉＲＮＡ效力的组合物。本发明专利技术一些实施方案提供了治疗疾病例如黑素瘤和乙型肝炎的方法，包括对于一个对象施用一种或多种能够下调一个或多个靶基因表达的ｓｉＲＮＡ以及一种或多种能够下调一个或多个ＲＮＡｉ负调节物的表达的ｓｉＲＮＡ。本发明专利技术还提供了包括一或多种能够下调一个或多个靶基因表达的ｓｉＲＮＡ或其前体以及能够下调一个或多个ＲＮＡｉ负调节物的表达的ｓｉＲＮＡ或其前体的组合物。

【技术实现步骤摘要】
使用siRNA 组合进行疾病治疗和在RNAi中提高siRNA效力的方法使用siRNA组合进行疾病治疗和在RNAi中提高siRNA效力的方法 专利
本专利技术涉及关于RNAi和siRNA的治疗学和分子生物学领域。特别地，本专利技术提供 了一种用于治疗疾病或病症的方法和一种提高RNAi效力的方法。本专利技术还提供了用于 治疗疾病或病症以及用以提高siRNA效力的组合物。本专利技术一些实施方案提供了治疗疾 病例如黑素瘤和乙型肝炎的方法。
技术介绍
下面是关于RNA干扰(RNAi)和小干扰RNA(siRNA)，及其在疾病治疗中的应用的 简单描述。本描述只是为了更好地理解后面所述的专利技术。本描述并不能被认为是承认所 述任何工作都已是本专利技术的现有技术。RNAi是一种在几乎所有真核生物中广泛保守的转录后基因沉默(PTGS)的现象， 其中双链RNA (dsRNA)诱导在细胞质中的同类mRNA进行序列依赖性降解，而这导致 相应基因的表达下调(参见Fire et al., 1998; Bosher et al.， 2000; Elbashir et al.， 2001; and Dykxhoometa1.，2003)。 RNAi现象最初于1990年在转基因植物中报道。随后几年中， RNAi在几乎所有真核生物中被观察到，包括秀丽隐杆线虫(CaeoWw6&toe/eg、果 蝇、斑马鱼和小鼠。在果蝇中已经确立了 RNAi机制的基本原理。当dsRNA被导入细胞中或由转基因 表达后，其首先被RNA III型酶家族的一个成员Dicer切割成为小干扰RNA(siRNA)， 所述siRNA长度大约为21—23核苷酸，在每条链3'末端含有两个核苷酸的突出(参见 Bernstein et al.， 2001)。然后siRNA被解旋酶分解为单链RNA分子并被引导进入RISC (RNA诱导的沉默复合物)以形成一个新的复合物。下一步，RISC中的单链RNA引导该 复合物寻找并降解其同类mRNA (参见Hammond etal., 2000)。由此相应基因的表达被下 调或抑制。在RNAi中，siRNA具有关键作用。RNAi被认为在植物中具有清除入侵病毒的重要作用，并且在秀丽隐杆线虫和小鼠 的发育中调节基因表达。除了在各种真核生物中的生理学作用外，RNAi也已经被证明 是在体外和体内对特定基因进行基因敲除的有力工具，并且据信siRNA在治疗涉及某些 基因的异常表达的疾病中也是一种有力工具，其中所述基因可以是人类基因或者是病毒 基因。RNAi调节下游靶基因的表达，但是干扰本身也被认为是处于调节之下的。例如， 在秀丽隐杆线虫中发现的ADAR(作用于RNA的腺苷脱氨酶)和一种高度保守的具有核酸外切酶活性的蛋白质ERI-1(增强的RNAi，其在人类和小鼠中的同源物称为THEX-1， 在小鼠中也称为MERI-1)己经被提示涉及RNAi调节(参见Yang et al., 2005; Knight et al., 2002; Tonkin et al.， 2003;和Kennedy et al., 2004)。然而，RNAi调节的机制还没有被阐 明。因此，明白RNAi调节的机制对于开发RNAi的有效的治疗、诊断及研究应用将是 必需的。在本领域中需要明白并应用RNAi调节的机制。明白RNAi调节的机制在高效 应用siRNA的方法中也将是有用的。专利技术概述在一些实施方案中，本专利技术提供了用于治疗疾病或病症的方法，包括对于一个对 象施用一种或多种能够下调一个或多个耙基因表达的siRNA以及一种或多种能够下调 一个或多个RNAi负调节物的表达的siRNA。在另一些实施方案中，本专利技术提供了提高siRNA效力的方法，包括对于一个生物 学系统施用一种或多种能够下调一个或多个耙基因表达的siRNA以及一种或多种能够 下调一个或多个RNAi负调节物的表达的siRNA。在另一些实施方案中，本专利技术提供了组合物，所述组合物包括一种或多种能够下 调一个或多个靶基因表达的siRNA或其前体，以及一种或多种能够下调一个或多个 RNAi负调节物的表达的siRNA或其前体。'在另外--些实施方案中，本专利技术提供了在治疗疾病或病症的方法以及提高siRNA 效力的方法中确定能够下调一个或多个靶基因表达的siRNA以及一种或多种能够下调 一个或多个RNAi负调节物的表达的siRNA的最佳比例的方法,所述方法包括下述步骤a) 使用任何siRNA分子诱导编码RNAi负调节物的基因的表达；b) 确定能够诱导RNAi负调节物的高表达的siRNA分子的有效剂量；c) 基于(b)中RNAi负调节物的高表达，确定将RNAi负调节物的表达下调至基 础表达水平的siRNA的剂量；以及d) 基于(c)中的RNAi负调节物的下调，确定将一个或多个靶基因的表达下调至 最低水平的siRNA的剂量。根据本专利技术一些实施方案中所提供的方法，耙向编码RNAi负调节物的Aex/基因 和/或任何其他与RNAi负调控相关的基因的siRNA可以与耙向耙基因的siRNA组合使 用，以显著提高所述靶向靶基因的siRNA的治疗效果或效力。本专利技术优选的实施方案所 提供的方法还可以在治疗应用中进一步降低靶向靶基因的siRNA的施用剂量，从而可以 降低治疗成本。本文提供的方法对于治疗癌症、病毒导致的疾病和任何涉及正常基因异 常表达的疾病都是有力的方法。附图简述附图说明图1示出了表达具有茎环节构的dsRNA的质粒载体pET-loop的图谱。图2示出了 pET-loop-2C-MYC的图谱。 图3示出了 pET-loop-2HBVP的图谱。 图4示出了 pET-loop-2MERI-l的图谱。 图5示出了 pET-loop-2MADARl的图谱。图6示出了使用CF-ll柱纯化的dsRNA。泳道1:含有pET-loop-2HBVP或 pET-loop-2MERI-l的大肠杆菌RNA提取物。泳道2:含有pET-loop的大肠杆菌RNA 提取物。泳道3:含有pET-loop-2HBVP或pET-loop-2MERI-l的大肠杆菌RNA提取物 用CF-ll纯化的样品。泳道4:含有pET-loop的大肠杆菌RNA提取物用CF-ll纯化的 样品。图7示出了 esiRNA(大肠杆菌表达的及酶消化的siRNA)的制备及纯化。A:不同量 的His-RNaseIII对dsRNA水解的效果，在泳道1_7分别使用了 0、0.1吗、0.25ng、0.5吗、 lpg、 2吗或4|xg His-RNaseIII; B:在Superdex-75柱上纯化的21-23 bp esiRNA。 图8示出了 CHO-iHBS细胞中esiHBVP对HBsAg表达的抑制。 图9示出了用不同量的esiHBVP转染的小鼠的血清中HbsAg的相对水平。 图10示出注射了不同剂量esiRNA的小鼠肝脏中禾Q flifor-7基因表达的 RT-PCR分析。A组和B组琼脂糖凝胶上的//za-7和o^ -/扩增产物的各自典型电泳 模式。C组和D组在三个独立实验中通过各自条带的强度分析确定的///^/和^/^^ 的mRNA水平的统计学分析。每条柱代表得自多于六只小鼠的测量的平均值。结果表 示为平均值士S.E.M.。 *户&本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高ｓｉＲＮＡ效力的方法，包括对于一个生物学系统施用一种或多种能够下调一个或多个靶基因表达的ｓｉＲＮＡ以及一种或多种能够下调一个或多个ＲＮＡｉ负调节物的表达的ｓｉＲＮＡ。

【技术特征摘要】
1.一种提高siRNA效力的方法，包括对于一个生物学系统施用一种或多种能够下调一个或多个靶基因表达的siRNA以及一种或多种能够下调一个或多个RNAi负调节物的表达的siRNA。2. —种组合物，其包括一种或多种能够下调一个或多个靶基因表达的siRNA或 其前体或编码其或其前体的一个或多个核苷酸序列，以及一种或多种能够下 调一个或多个RNAi负调节物的表达的siRNA或其前体或编码其或其前体的 一个或多个核苷酸序列。3. 权利要求1的方法或权利要求2的组合物，其中能够下调靶基因表达的siRNA 与能够下调RNAi负调节物的表达的siRNA的比例为10:1 (w/w)。4. 权利要求1的方法或权利要求2的组合物，其中所述靶基因是与疾病相关的 基因，其下调使所述疾病好转。5. 权利要求1的方法或权利要求2的组合物，其中所述靶基因是eye基...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄伟达，洪浩，钱志康，
申请(专利权)人：上海恒达科技发展股份有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]