反相柱层析制备小牛脾提取物注射液及制备方法技术

本发明专利技术公开一种反相柱层析制备小牛脾提取物注射液及制备方法，将原小牛脾提取物溶液进行反相柱层析纯化，纯化工艺简便，明显提高产品稳定性与药理活性的质量标准。打破了常规的吸附、洗脱离子交换柱层析方法，采用反相离子交换层析方法，减少了生产工艺流程，达到了提高产品质量标准的要求；本发明专利技术产品与原小牛脾提取液相比具有毒副作用小、色素杂质含量低，杂质含量降低，从而使毒副作用减小。高效液相色谱７号峰面积百分比由反相层析前的１７．６６％提高到层析后的５１．８２％，单位有效成分含量高。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及小牛脾提取物注射液的生产工艺，尤其是提供一种反相柱 层析制备小牛脾提取物注射液及制备方法，属于生物制药
技术背景许多研究证实生物体内的多种组织细胞和体液中广泛存在着低分子抑 瘤物，可能是组织细胞特定合成的或物质代谢的中间产物。其结构和理化 特性不一，但在生物体内清除恶性转化细胞、防止肿瘤发生与发展的过程 中起着重要的作用。文献报道，从猪脾中提取的多肽类物质具有天然生物学活性，不但能抑制肿瘤的生长，尚能刺激免疫系统，促使干扰素释放，增加T细胞活性， 整体性地提高机体免疫能力及抗癌能力。目前国内对脾肽的研究较少，有 文献报道以牛脾为原料，采用超滤和离心技术制备脾脏低分子抑瘤物。小牛脾提取物注射液可用于提高机体免疫力，明显提高白细胞数目。 可在治疗再生障碍性贫血、原发性血小板减少症、放射线引起的白细胞减 少症、各种恶性肿瘤、改善肿瘤患者恶液质时配合使用。然而，目前市场 销售的小牛脾提取物注射液产品杂质较多，时有过敏反应发生，且药理活 性不稳定，影响了该药品的使用疗效。
技术实现思路
本专利技术提供一种小牛脾提取物注射液，升白作用明显高于原有产品。 本专利技术还公开了小牛脾提取物注射液的制备方法，将原小牛脾提取物溶液进行反相柱层析纯化，纯化工艺简便，明显提高产品稳定性与药理活 性的质量标准。本专利技术的小牛脾提取物溶液，其特征在于为淡黄色澄清溶液；pH值为5.0 7.0;分子量4000-6000道尔顿；加水制成每lml中含多肽20ug的溶液，照分光光度法测定，在194nm 的波长处有最大吸收；蛋白质小牛脾提取物溶液2.0ml，加20%磺基水杨酸溶液2.0ml，混 匀，不得发生浑浊；吸收度小牛脾提取物溶液加水制成每lml中含多肽20ug的溶液，在 260nm与280nm波长处吸收度的比值应为2.0~2.5。本专利技术小牛脾提取物溶液的制备方法包括以下步骤1、 取小牛脾提取物注射液200ml，上样于阴离子交换层析柱进行反相 层析(包括DEAE纤维素，大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂等阴离子 交换剂)；2、 平衡液为5 20mmol/ml、 pH5 7的磷酸缓冲液；3、 收集具有升高白细胞作用的活力峰。 最佳工艺路线如下1、 取小牛脾提取物注射液200ml，上样于400ml大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂层析柱进行反相层析；2、 平衡液为10mmol/ml、 pH5 7的磷酸缓冲液；3、 收集具有升高白细胞作用的活力峰。本专利技术的积极效果在于打破了常规的吸附、洗脱离子交换柱层析方法，采用反相离子交换层析方法，减少了生产工艺流程，达到了提高产品质量标准的要求；本专利技术产品与原小牛脾提取液相比具有毒副作用小、色 素杂质含量低，杂质含量降低，从而使毒副作用减小。高效液相色谱7号 峰面积百分比由反相层析前的17.66%提高到层析后的51.82%，单位有效 成分含量高。 实验例l精制小牛脾提取物注射液活力药理实验 采用白细胞计数考察本小牛脾精制液的升高白细胞作用 1.1活力测定将本品加水制成每lml中含多肽2.5mg的溶液，作为供试品溶液。选 2 3kg的健康家兔3只，注射前检査白细胞数，而后进行肌肉注射，剂量按 家兔体重lkg肌肉注射供试品溶液lml，于注射后24小时检查白细胞数。 1.3实验结果1.3.1本精制小牛脾提取物注射液(多肽浓度为2.5mg/ml)，按体重给药后， 注射前后白细胞数目平均升高1.36倍 1.3.2实验数据表肌肉注射给药考察本精制溶液升白效果与精制前的对比。<table>table see original document page 5</column></row><table>与注射前空白对照组对照*****P<0.000001。参见图l、图2。 附图说明图1为小牛脾提取物注射液阴离子交换树脂层析前高效液相色谱图； 图2为小牛脾提取物注射液阴离子交换树脂层析后高效液相色谱图。具体实施方式本专利技术以小牛脾提取物注射液为原料，具体实施步骤如下，但并不意 味着对本专利技术范围的限制。 实施例l1、 取小牛脾提取物注射液200ml，上样于阴离子交换层析柱进行反相 层析(DEAE纤维素)；2、 平衡液为5 20mmol/ml、 pH5 7的磷酸缓冲液；3、 收集具有升高白细胞作用的活力峰。 实施例21、 取小牛脾提取物注射液200ml，上样于400ml大孔弱碱性丙烯酸系 阴离子交换树脂层析柱(D311)进行反相层析；2、 平衡液为10mmol/ml、 pH5 7的磷酸缓冲液；3、 收集具有升高白细胞作用的活力峰。见图2。 实施例31、 取小牛脾提取物注射液lOOml，上样于250ml 330弱碱性环氧系阴离子交换树脂层析柱；2、 平衡液为5 20mmol/ml、 pH5 7的磷酸缓冲液；3、收集具有升高白细胞作用的活力峰。见图2。 实施例41、 取小牛脾提取物注射液200ml，上样于400ml大孔弱碱性丙烯酸系 阴离子交换树脂层析柱(DE51、 DE52、 DE53、 QA52)进行反相层析；2、 平衡液为10mmol/ml、 pH5 7具体的pH6.3的水缓冲液；3、 收集具有升高白细胞作用的活力峰。见图2。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小牛脾提取物溶液，其特征在于：为淡黄色澄清溶液；ｐＨ值为５．０～７．０；分子量４０００－６０００道尔顿；加水制成每１ｍｌ中含多肽２０ｕｇ的溶液，照分光光度法测定，在１９４ｎｍ的波长处有最大吸收；蛋白质：小牛脾提取物溶液２．０ｍｌ，加２０％磺基水杨酸溶液２．０ｍｌ，混匀，不得发生浑浊；吸收度：小牛脾提取物溶液加水制成每１ｍｌ中含多肽２０ｕｇ的溶液，在２６０ｎｍ与２８０ｎｍ波长处吸收度的比值应为２．０～２．５。

【技术特征摘要】
1、一种小牛脾提取物溶液，其特征在于为淡黄色澄清溶液；pH值为5.0～7.0；分子量4000-6000道尔顿；加水制成每1ml中含多肽20ug的溶液，照分光光度法测定，在194nm的波长处有最大吸收；蛋白质小牛脾提取物溶液2.0ml，加20％磺基水杨酸溶液2.0ml，混匀，不得发生浑浊；吸收度小牛脾提取物溶液加水制成每1ml中含多肽20ug的溶液，在260nm与280nm波长处吸收度的比值应为2.0～2.5。2、 如权利要求1所述小牛脾提取物溶液的制备方法，其特征在 于以小牛脾为原料制得的水溶液，经反相阴离...

【专利技术属性】
技术研发人员：滕利荣，田晓乐，张志文，孟庆繁，逯家辉，袁利佳，
申请(专利权)人：吉林敖东洮南药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：22[中国|吉林]