用于诊断、预防和／或护理特征为β－淀粉和／或淀粉样物质在人和／或动物器官和组织中异常沉积的人和／或动物病理的产物及它们的应用、和用于确定这种病理风险的筛选方法技术

本发明专利技术涉及基于在纯合性或杂合性的情况下对β－蛋白的２位的点状突变Ａｌａ＞Ｖａｌ（对应于含有７７０个氨基酸的β－蛋白的Ａｌａ６７３Ｖａｌ突变前体）的研究，对从人和／或动物有机体分离的生物材料进行筛选以确定表现为β－淀粉和／或淀粉样物质在人和／或动物器官和组织中异常沉积的人和／或动物病理的风险的方法。本专利提供下列可行性：（１）产生表达Ａｌａ６７３Ｖａｌ突变的单细胞或多细胞转基因有机体；（２）合成或制备具有这种突变的肽和／或它们的衍生物、和／或含有相同突变的核酸；（３）使用这些产物研究特征为β－淀粉和／或淀粉物质的异常沉积的病理的发病机理以及这些疾病的预防、诊断和护理。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】阿尔茨海默氏病是老人痴呆的最普通的形式。其为退化性疾病，临床特征为认知功能的不断下降，神经病理学特征为β-淀粉质(Aβ)和τ蛋白的不溶性聚集体在大脑皮层和皮质下灰质中的积累。Aβ以细胞外淀粉质的形式沉积在神经纤维网(老年斑)中和脑血管(嗜刚果红血管病)中，而τ形式的蛋白形成异常神经元内间丝(神经元纤维变性)(LoveS.Neuropathologicalinvestigationofdementia：aguideforneurologists.JNeurolNeurosurgPsychiatry76，Suppl5：v8-14，2005)(图1)。在95％的情况下，阿尔茨海默氏病是偶发性的，而在约5％的情况下其具有家族特征并且和下列3种基因的突变有关：染色体14上的早老素1(PSEN1)、染色体1上的早老素2(PSEN2)、和染色体21上的β-淀粉质前体(APP)。在这些情况下，所述疾病通常比偶发性形式更早发作，并且以高渗透性常染色体显性类型的机理来传播。AD的发病原理仍未完全理解，但是在最近十几年，“淀粉质瀑布”假说(Wilquetetal.Amyloid-betaprecursorproteinprocessinginneurodegeneration.CurrOpinNeurobiol14：582-8，2004；Leeetal.Perspectivesontheamyloid-betacascadehypothesis.JAlzheimersDis6：137-45，2004)日益被证实，其在家族(FAD)和偶发性形式中都将核心作用归因于Aβ。Aβ通过称为“淀粉质源途径”的分解代谢途径衍生自其β-APP前体(图2)。这种途径通过两种蛋白酶(β-分泌酶和γ-分泌酶)来提供用于β-蛋白的分子上游和下游的裂解。β-分泌酶(BACE)的切断产生长的可溶性N-末端片段(sAPPβ)和99个氨基酸的C-末端肽(C99)。其进一步被γ-分泌酶切成对应于Aβ和小的C-末端肽(AICD)的两个片段(SelkoeDJ.Decipheringthegenesisandfateofamyloidβ-proteinyieldsnoveltherapiesforAlzheimerdisease.JClinInvest110：1375-81，2002)。事实上，γ-分泌酶具有两个主要的裂解位点，其导致形成“短”和“长”形式的Aβ(Aβ1-40和Aβ1-42)，在正常条件下它们的比例为10∶1。类似地，BACE可在肽的不同点发挥作用，从而在N-末端区域产生截短形式(例如Aβ11-40、Aβ11-42和Aβ3-42)，这通常导致AD增加(Liuetal.CharacterizationofAβ11-40/42peptidedepositioninAlzheimer’sdiseaseandyoungDown’ssyndromebrains：implicationofAlzheimer’sdisease.ActaNeuropathol112：163-74，2006)。由于蛋白被另一种蛋白酶(α-分泌酶)在Aβ残基16-17切断，因此βAPP可进行称为“非淀粉质源”的可选择的分解代谢途径。因此，后面酶的作用排除β-淀粉质的形成。淀粉质瀑布假说由多个证据支持：●AD的基因APP决定家族形式突变(Rademakersetal.，GeneticsofEarly-OnsetAlzheimerDementia.ScientificWorldJournal16：497-519，2003)；●基因APP的额外拷贝的存在(这在唐氏综合症中证实)足以确定AD的临床病-->理学描述；●AD的大多数遗传决定形式与Aβ的产生增加、Aβ42/Aβ40比例增大有关(Kahleetal.Attackon淀粉质.EMBORep4：747-51，2003)；●Aβ、特别是“长”的42-残基形式表现出强的聚集为低聚物以形成淀粉质原纤维(其表示老年斑的主要要素)的趋势(ArmstrongRA.PlaquesandtanglesandthepathogenesisofAlzheimer’sdisease.FoliaNeuropathol44：1-11，2006)；●Aβ、特别是42氨基酸形式是神经毒性的(Butterfieldetal.Amyloidbeta-peptide(1-42)contributestheoxidativestressandneurodegenerationfoundinAlzheimerdiseasebrain.BrainPathol14：426-32，2004)；●转基因鼠(与AD关联的APP基因的载体)在中枢神经系统中积累β-淀粉质，并且表现出行为-认知范围的缺陷，这取决于年龄而加重(Kurtetal.Neurodegenerativechangesassociatedwithbeta-amyloiddepositioninthebrainsofmicecarryingmutantamyloidprecursorproteinandmutantpresenilin-1transgenesExpNeurol171：59-71，2001)；●针对表达人APP的转基因鼠的Aβ的变异降低了淀粉质斑的形成，并且改善了其神经学缺陷(Lemereetal.Amyloid-betaimmunizationinAlzheimer’sdiseasetransgenicmousemodelsandwildtypemice.NeurochemRes28：1017-27，2003)。关于遗传决定形式，约80％的家族AD情况与PSEN1和PSEN2突变关联(Rocchietal.CausativeandsusceptibilitygenesforAlzheimer’sdisease：areview.BrainResBull61：1-24，2003)。两种早老素都涉及Aβ(其为γ-分泌酶的大分子络合物的部分)的产生，并且它们的突变情况涉及Aβ(上述所有Aβ1-42)产生的增加，这具有形成神经毒性聚集体的高的趋势。约5％的FAD由位于APP基因上的突变引起(Rocchietal.CausativeandsusceptibilitygenesforAlzheimer’sdisease：areview.BrainResBull61：1-24，2003)(图2)。这些突变中的一些通过利于在二级β-片层结构富集Aβ构象来发挥它们的病原作用，结果是溶解度和针对聚集的趋势降低。另一方面，其他突变干扰APP的加工，原因在于它们位于分泌酶发挥作用的分子位点处(例如“瑞典型突变”KM670/671NL)。仍有其他者利用完全未知的机理来引起长的和不溶形式的Aβ(Aβ1-42和Aβ1-43)的生产积累。在与APP或早老素突变关联的AD情况中，Aβ1-42增加直到其占分泌的Aβ肽的15-40％为止，而在正常条件下其只占其的5-10％(Rocchietal.CausativeandsusceptibilitygenesforAlzheimer’sdisease：areview.Bra本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于以纯合子或杂合子形式、在编码人ＡＰＰ基因（Ｄ８７６７５）的序列的密码子６７３处胞嘧啶被胸腺嘧啶置换的研究，对人生物材料进行筛选以确定病理的方法，所述病理的特征在于由Ａβ的任何异形体形成的β－淀粉和／或淀粉样物质的异常沉积，所述研究对应于ＡＰＰ７７０异形体（ＮＭ＿０００４８４．２）的核苷酸２２１２（ｃ．２２１２Ｃ＞Ｔ转变），所述突变导致在ＡＰＰ７７０的残基６７３处或在对应于Ａβ的２位的ＡＰＰ的其他异形体的类似残基处丙氨酸被缬氨酸置换。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】IT 2007-10-12 MI2007A0019751.一种基于以纯合子或杂合子形式、在编码人APP基因(D87675)的序列的密码子673处胞嘧啶被胸腺嘧啶置换的研究，对人生物材料进行筛选以确定病理的方法，所述病理的特征在于由Aβ的任何异形体形成的β-淀粉和/或淀粉样物质的异常沉积，所述研究对应于APP770异形体(NM_000484.2)的核苷酸2212(c.2212C＞T转变)，所述突变导致在APP770的残基673处或在对应于Aβ的2位的APP的其他异形体的类似残基处丙氨酸被缬氨酸置换。2.根据权利要求1所述的筛选方法，基于信使RNA(mRNA)被这样的基因转录的研究，所述基因编码根据点1具有所述突变的人APP的各种异形体，或在APP770的密码子673处具有其他突变。3.根据权利要求1所述的筛选方法，基于含有所述Ala673Val突变的蛋白APP和/或其异形体的研究，所述突变对应于Aβ的2位或在APP770的密码子673处具有其他突变。4.根据权利要求1和2所述的筛选方法，其特征在于，其包含从任何生物材料分离所述基因组DNA和/或RNA和对它们进行测序。5.根据前述权利要求中的一项或多项所述的筛选方法，其特征在于，其包括通过所述DNA的非同位素分析来研究所述突变。6.根据前述权利要求中的一项或多项所述的筛选方法，其中所述突变的研究通过使用限制性内切酶和/或DHPLC(去活高效液相色谱法)和/或SSCP(单链构型多态性分析法)和/或原位杂交法来进行。7.根据前述权利要求中的一项或多项所述的筛选方法，其特征在于，所述DNA得自从患者血液中分离的白细胞。8.根据权利要求1-7所述的筛选方法，其特征在于一种所述病理是典型形式或以非典型显型表达的AD。9.构建体，其特征在于，其在任何非内源性启动子控制下携带人APP或它们片段的不同异形体，所述人APP或它们片段在APP770或它们片段的密码子673处具有Ala673Val突变或其他突变。10.根据前述权利要求所述的构建体，其特征在于其在启动子Thy1.1或Thy1.2控制下携带人APP或其片段，所述人APP或其片段在APP770或它们片段的密码子673处具有Ala673Val突变或其他突变。11.根据权利要求9所述的构建体，其特征在于其在巨细胞病毒(Pcmv)的启动子控制下携带人APP或其片段，所述人APP或其片段在APP770或它们片段的密码子673处具有Ala673Val突变或其他突变。12.任意细胞系，其特征在于，其以稳定或瞬间方式用根据权利要求9-11所述的构建体转染。13.转基因非人哺乳动物，其特征在于，其以杂合子或纯合子形式携带所述DNA序列或其片段，所述DNA序列或其片段编码人APP或它们片段的不同异形体，所述人APP或它们片段在APP770或它们片段的密码子673处具有Ala673Val突变或其他突变。14.提供敲除用于内源性APP的转基因非人哺乳动物，其特征在于，其携带所述DNA序列或其片段，所述DNA序列或其片段编码人APP或它们片段的不同异形体，所述人APP或它们片段以纯合子形式(基因型APP673v/APP673v)、或半合子形式(基因型APP0/APP673v)、或杂合子(基因型APP673A/APP673v)在APP770或它们片段的密码子673处具有Ala673Val(APP673v)突变或其他突变。15.根据权利要求13和14所述的转基因非人哺乳动物，其特征在于，其以纯合子、半合子或杂合子形式携带所述DNA序列或其片段，所述DNA序列或其片段编码人APP或它们片段的不同异形体，其中所述Ala673Val突变(或在APP770或它们片段的密码子673处的其他突变)和其他突变相关联。16.根据权利要求13-15所述的转基因非人哺乳动物，其特征在于，其以纯合子、半合子或杂合子形式携带所述DNA序列或其片段，所述DNA序列或其片段编码人APP或它们片段的不同异形体，其中所述Ala673Val突变、(或在APP770或它们片段的密码子673处的其他突变)和在编码早老素1(PSEN1)的基因中的突变相关联。17.根据权利要求13-15所述的转基因非人哺乳动物，其特征在于，其以纯合子、半合子或杂合子形式携带所述DNA序列或其片段，所述DNA序列或其片段编码人APP或它们片段的不同异形体，其中所述Ala673Val突变、(或在APP770或它们片段的密码子673处的其他突变)和在编码早老素2(PSEN2)的基因中的突变相关联。18.根据权利要求13-15所述的转基因非人哺乳动物，其特征在于，其以纯合子、半合子或杂合子形式携带所述DNA序列或其片段，所述DNA序列或其片段编码人APP或它们片段的不同异形体，其中所述Ala673Val突变、(或在APP770或它们片段的密码子673处的其他突变)和在编码τ蛋白(MAPT)的基因中的突变相关联。19.根据权利要求13-15所述的转基因非人哺乳动物，其特征在于，其以纯合子、半合子或杂合子形式携带所述DNA序列或其片段，所述DNA序列或其片段编码人APP或它们片段的不同异形体，其中所述Ala673Val突变、(或在APP770或它们片段的密码子673处的其他突变)和基因PSEN1和/或PSEN2和/或MAPT中的突变组合相关联。20.根据权利要求13所述的转基因非人哺乳动物，其特征在于，其是敲除物，其中所述内源性APP在内源性启动子控制下通过非同源重组经过人APP或其片段而置换，所述人APP或其片段在APP770或它们片段的密码子673处具有Ala673Val突变或其他突变。21.根据权利要求13-20所述的转基因哺乳动物，其特征在于，其为啮齿动物。22.根据权利要求13-20所述的转基因哺乳动物，其特征在于，其是任何株的鼠。23.转基因动物，其特征在于，其是任何动物有机体，所述动物有机体表达人APP或其片段，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：G迪费德，M莫斌，F塔格利维尼，A马蒂尼，
申请(专利权)人：卡罗贝斯塔神经学会IRCCS基金会，
类型：发明
国别省市：IT