制备方法技术

一种保存和纯化来自全血样本的细胞的方法，包括在纯化细胞之前和／或之后保存该样本至少６小时，以及纯化一群淋巴细胞和抗原呈递细胞以供在细胞介导免疫分析（ＣＭＩ分析）中使用，所述纯化通过一种引入正向或负向亲和选择步骤的方法来进行。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及保存和纯化来自全*本的细胞的方法。具体而言，本专利技术涉 及4絲和纯化来自全*本的细胞的方法，以使得一群淋巴细#抗原呈递细月^皮有效稳定化和纯化，以供用于体外测量细胞介导免C^答的分析中。
技术介绍
细胞介导免疫(CMI)应答通常用于确定个体的免疫状态。通常，在临床免 疫学领域，术语CMI应答涵盖体内皮试、淋巴细自殖分析以#特异性抗原了用于，、^定化^^制备来自分离的全本的细胞的改进的方法,以:用、 于测量一类CMI应答的分析技术(下文称作CMI分析)，所述CMI应答即针 对特异性抗原的、基于细胞因子的体外CMI应答。免疫系统的细胞在受到抗原的刺激后能够产生免疫效应物分子，例如细胞 因子。CMI分析包括将细M本与一种抗原^温育，并测量免疫效应物^ (例如细胞因子)是否存在或者存在的量，以提供个体针对所选抗原产生细胞介 导免疫应答的能力的指征。在CMI分析中使用的细|^￡包括分离的淋巴细|^ (特别是T细^)和抗原呈递细胞(APC)群。APC参与抗原的加工，以使得该 抗原可以被每个T细J^4面的T细胞受体识另，J。抗原诱导的细胞因子可被員 到分析介质中，并通过例如ELISA的方法直接测定，或者对分泌细胞因子的T 细胞的频率佳月ELISP0T方法ii^f于定量。过滤免疫蚀斑分析也称酶联免疫斑点分析(ELISPOT)，在开发之初用于对 个别的分泌抗体的B细Jf&i^ff^r测和定量。在该技7M皮开发出来时，它为常规 的蚀斑形成细胞分析提供了快速的、多用途的替代方案。最近的改进已经提 高了 ELISP0T的灵M，以致可以^测到每秒产生低至100个特异性蛋白质分 子的细胞。这些分析利用了在紧邻分泌蛋白质的细胞的环境中的较高深度的给 定的蛋白质性细胞产物(例如细胞因子)。这些细胞产物利用高亲和性抗体进行捕捉和检测。ELISPOT分析的综述可参考Current Protocols in Immunology, Unit 6.19 pages 6.19. 1-8。ELISP0T分析通常包括六个步骤(1)在膜支持的微滴定;tUi包被纯化的 细胞因子特异性抗体；(2)封闭该板，以防止非特异性吸附^^T其他的蛋白质； (3)将分泌细胞因子的细胞与适当的试剂-^温育；(4)除去细#试剂；(5) 加入标记的第二抗细胞因子抗体；以及(6)枱r测膜上的抗体-细胞因子复合物。从全血样本制备用于CMI分析的细胞的目前的方法包括使用聚糖体 (Ficoll)梯度来分离外周血单核细胞(PBMC)。梠^据这些方法，为了有效进行 CMI分析，淋巴细胞和APC必须从全械本中尽快纯化，糾地il l在从个体 采集血液样本后的8小时内。
技术实现思路
本专利技术人已经专利技术了保存和纯化来自全jfc^本的细胞，以供在细胞介导免 疫分析(CMI分析)，如ELISP0T分析中使用的方法。*明了在^之前处理 全j6l^羊本的方法。这些方法可使全jfe^本在CMI分析，例如ELISP0T分析中使 用之前^皮保存例如至少6小时，如多至48小时。本专利技术提供了一种M和纯化来自全血样本的细胞的方法，包括在纯化细 胞之前和/或^絲该样本至少6小时，以及纯化一群淋巴细胞和APC以供 在细胞介导免疫分析(CMI分析)中^J^！,所述纯^if过一种引AiL向或负向亲和it择步骤的方法^Mi^f亍。本专利技术在另一方面提[种处理和M全j6^本的方法，包括使用生长培 养基稀释所述全i^羊本；并且将处理过的全j&^羊本絲至少6小时，其中，在 4錄之后，可获得一群淋巴细胞和APC以供在CMI分析中使用。在M之后， 可从稀释的全*本中分离PBMC或者淋巴细胞和APC的适当的制剂以供在 CMI分析，如ELISP0T分析中^J l。本专利技术在另 一方面^^种在ELISP0T分析中員来自全血的、分离的T 细胞的肽特异性细胞因子应答的方法，包括^f捐正向或负向亲和选择>^^斤述全 jM羊本中分离一群包括T细# APC的细胞。本专利技术在另一方面R供一种制备适用于ELISP0T分析的淋巴细胞和APC 的方法，其中，所述方法包^it过iiy虑除去红细胞。具体实施例方式本专利技术提供了一种保存和纯化来自全*本的细胞以供在CMI分析，如 ELISP0T分析中使用的方法。本专利技术还提供了 一种通过^J^)细胞生长培养基稀 释来处理全jk^羊本、##存该处理的全*本的方法。该方法^f吏得来自所# 液样本的分离的淋巴细# APC的肽特异性细胞因子应答足以在CMI分析，如 ELISP0T分析中使用，优逸地用在i貪断方法中。根据本专利技术，细^^h导免疫^^斤(CMI分析)是指用于测量4十对特异性抗原 的、基于细胞因子的细胞介导免疫应答的体外分析。此类分析^^)从个体中获 得的样本，其中所述样本包括免疫系统的细胞。该免疫系统的细胞在受到抗原 刺激后能够产生免疫效应物M，如细胞因子。该分析包括将该样本与一种抗 原^温育，并测量免疫效应物^ (例如细胞因子)是否存在或者存在的量， 以提供个体针对所选抗原产生细胞介导免疫应答的能力的指征。本专利技术中，CMI 分析优选为ELISPOT分析。在CMI分析，如ELISPOT分析中使用的细胞包括分 离的淋巴细# APC群，例如一群T细# APC。根据本专利技术方法制备的分离的淋巴细胞和APC制剂、特别是T细胞和APC 制剂可用于CMI分析，如ELISPOT分析，以用于诊断。该制剂产生足以进4tit 断的应答。该应答可被P艮定为高于本底的50%。或者，该应答可被限定为佳月 刚刚分离的全jk4羊本所能获得的最;Ul答的至少50%。例如，在通常的分析中，在ELISP0T分析的每个孔中可使用2. 5xl(f个 存活的PBMC。在结核病的ELISPOT分析中，阴性对照通常少于5个斑点。在 这种情况下，P曰性或M性样本应比阴性对照多6个或6个以上斑点。如果阴 性对照有6个或6个以上斑点，则只有在斑点数量为阴性对照的两倍以上时才 表明^JI性样本。在本专利技术方法的一个实施方案中，在*之前或之后，使用正向亲和选择 步骤或负向亲和选择步骤来纯化来自全*本的细胞。正向亲和选择步骤用于 将所需细胞结合至固体支持物上，从而使结合的细胞与^合的细胞分离。纯 4匕的结合的细胞^t保留，未结合的细l&^:丢弃。另一方面，负向亲和选择步骤用于除去那些在用于CMI分析，如ELISP0T 分析的细胞制剂中不需要或不想要的细胞。因而，结合至固体支持物的细胞被 丢弃，纯化的未结合的细g回收并床留。该方法使淋巴细胞(如T细胞)和APC都得到纯化。该纯化可包拾淋巴细胞 和APC两者的正向或负向亲和选择，在这种情况下，通常样本中这两种细胞类 型都得到富集，即，作为实施本专利技术方法的结果，样本中T细J^细胞总数的 比例和APC对细胞总数的比例都升高。根据本专利技术的一个方面，在通过包括正向或负向亲和选择步骤的方法对来 自全jMf本的细胞进行纯^iL前和/或之后，将该全jM羊^i行保存。例如， 该全jM羊本可在分离所选细lfe^ML前进行保存。在保存至少6小时、至少8 小时、多达IO、 12、 18、 24、 36或48小时之后，处理(即进行亲和选择)该全 jfa^羊本以分离所选细胞群，然后可用于CMI分析，如ELIS本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种保存和纯化来自全血样本的细胞的方法，包括在纯化细胞之前和／或之后保存该样本至少６小时，以及纯化一群淋巴细胞和抗原呈递细胞以供在细胞介导免疫分析（ＣＭＩ分析）中使用，所述纯化通过一种引入正向或负向亲和选择步骤的方法来进行。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】GB 2006-10-6 0619853.51.一种保存和纯化来自全血样本的细胞的方法，包括在纯化细胞之前和/或之后保存该样本至少6小时，以及纯化一群淋巴细胞和抗原呈递细胞以供在细胞介导免疫分析(CMI分析)中使用，所述纯化通过一种引入正向或负向亲和选择步骤的方法来进行。2. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述样^M^保存至少IO小时。3. 根据权利要求2所述的方法，其中，所述样^^皮M至少12小时。4. 根据权利要求3所述的方法，其中，所述样^^皮保存12至36小时之间、 12至48小时或者24至48小时。5. 根据上i^K利要求中任一项所述的方法，其中，所述样4^皮*在2-8。C。6. 根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述样4^皮*在18-25 C。7. 根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述纯化方法包括负向亲 和选择步骤以除去粒细胞。8. 根据权利要求7所述的方法,其中，所述方法包括使该样本与包括抗CD66b 和血型糖蛋白A抗体的抗体制剂相接触，以使红细^粒细胞疑集，并且 通过离心>^^斤述制剂中除去所述红细#粒细胞。9. 根据权利要求7所述的方法，其中，所述粒细胞的除去是通过使所述样本 与包括抗CD15配体的固体支持物相接触以从该样本中除去CD15+细胞来 实现的。10. 根据权利要求9所述的方法，其中，所述固体支持物包括#,并且其中， 该方法包括使该样本与该^M目接触以使CD15+细胞与该^K结合，以及 从该样本中分离结合有CD15+细胞的^K。11. 根据权利要求9至10中任一项所述的方法，其中，该样本中的红细Jf&it 过裂解或过滤除去。12. 根据上it^L利要求中任一项所述的方法，其中，所述纯化导致该样本中T 细胞对总细胞的比例和抗原呈递细胞对总细胞的比例均升高；和/或其中， 该样^4保存或者纯化或者在CMI分析中佳月之前的任何时间都不被冷 冻。13. 权利要求1至6中任一项所述的方法，它包括对所述细胞的正向亲和选择 步骤，其中任选地，该亲和选择步^it择所有类型的T细胞。14. 根据权利要求13所述的方法，其中，所述方法包括将所述样本与附着有 配体的固体支持物接触，从而分离淋巴细^抗原呈递细胞制剂，其中所 述配体可结合存在于所逸林巴细胞和抗原呈递细胞的表面的细J!fe^面蛋 白。15. 根据权利要求14所述的方法，其中，所述固体支持物包括抗CD4、抗CD8、 抗CD19和抗CD14配体中的一种或多种，以便将CD4+、 CD8+、 CD19+和/ 或CD14+细JJ&^全j6M^本中分离。16. 根据权利要求14或15所述的方法，其中，在用于分析之前，将所述淋巴 细胞和抗原呈递细胞制剂从该固体支持物上分离。17. 根据权利要求14或15所述的方法，其中，所逸林巴细胞和抗原呈递细胞 制剂被保留在所述固体支持物Ji^分析中^fM 。18. 根据权利要求14至17中任一项所述的方法，其中，所述固体支持物包括19. 才...

【专利技术属性】
技术研发人员：I杜兰特，T戴，A奥基夫，M班普顿，
申请(专利权)人：牛津免疫科技有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]